Aplicación de Mutagénesis por Transposición y Secuenciación Masiva para el Estudio Funcional de Genes Codificados por Enterococcus faecium

Abstract

[ES] Se transformará una cepa multirresistente de E. faecium con un plásmido (pZXL5) que contiene un transoposón que codifica para resistencia a gentamicina y se inserta aleatoriamente en el genoma de la bacteria. las bacterias que hayan insertado el transposón en el genoma bacteriano. Se crecerán 20 de las colonias identificadas, se extraerá su DNA y mediante Shouthern Blot se comprobará que la inserción ha sido aleatoria y que únicamente una copia del transposón se ha insertado en el cromosoma. Seguidamente se utilizará la secuenciación masiva para detectar el lugar de inserción del transposón en el cromosoma con una mezcla bacteriana que contenga aproximadamente 108 mutantes. Posteriormente serán infectados ratones. Dos días tras la infección se tomarán muestras del intestino, se extraerá su DNA y se analizarán los sitios de inserción del transposón en el cromosoma. A partir de estos datos definirán aquellos genes que pudieran ser importantes para la colonización intestinal de Enterococo

[EN] The aim of this work is to elaborate an appropriate methodology to identify genes encoded by multidrug-resistant strains of Enteroccus faecium which are necessary for colonization of the intestinal tract. In order to do so, a mutagenesis system by transposition and massive sequencing will be used. The strain E1162 Enterococcus faecium will be transformed with the pZXL5 plasmid which contains a gentamicin resistant coding transposon that will be randomly inserted into the bacterial genome. The pZXL5 plasmid is temperature sensitive making it unable to replicate at temperatures above 30ºC. The strain transformed with the plasmid will be grown in medium with gentamicin at a temperature above 30ºC, obtaining only those bacteria where the transposon was randomly inserted in the genome. Finally, by massive sequencing technique, the transposon insertion site in the chromosome will be identified and the relative abundance of mutants will be measured.