Desarrollo de un protocolo de PCR a tiempo real para la detección y cuantificación del inóculo de Phaeomoniella chlamydospora en campo

Abstract

[EN] Phaeomoniella chlamydospora is one of the fungal pathogens associated to grapevine trunk diseases (GTD), which cause significant economic losses to the wine industry worldwide. For GTD management it is necessary to minimize infection risk through pruning wounds since the time of planting. Thereby, knowledge of pathogen inoculum dynamics in field and its relationship with the environmental conditions is essential to support decision-making in GTD management.

One of the methods used for monitoring the airborne inoculum of plant pathogenic fungi in field is the Burkard system, which takes samples of the airborne particles by impact on a tape for the subsequent quantification of spores by observation under microscope. This process is complex, so that molecular techniques can represent an effective alternative to detect and quantify fungi in environmental samples.

The aim of this research is the development of P. chlamydospora extraction, detection and quantification protocol using nested PCR and real-time PCR. To this aim, tapes with known concentrations of conidia obtained in vitro and Burkard samples from field were used.

At first, a stock solution with high concentration of conidia was prepared (5 x 107 conidia/mL) from P. chlamydospora grown in vitro and serial dilutions were made to 10 conidia/mL. Known quantities of each dilution were applied on tapes and DNA extraction was made.

A nested PCR was needed for low concentrations of DNA detection. In the first round of PCR reaction the Internal Transcribed Spacers (ITS) of the rDNA were amplified with universal primers. Resulting products were used as DNA template in second round real-time PCR using specific primers for P. chlamydospora.

Slides with tapes were exposed in several vineyards localized in Onteniente, Albacete and Requena for the application of the protocol. Two slides were collected every week on each vineyard and they were processed to extraction, nested PCR and real-time PCR methods previously developed.

[ES] Phaeomoniella chlamydospora es uno de los hongos fitopatógenos implicados en las enfermedades de madera de la vid (EMV), que causan importantes pérdidas en el sector vitícola. Para el control de las EMV es necesario minimizar el riesgo de infección a través de heridas de poda desde el momento de la plantación en el viñedo. En este sentido, conocer la disponibilidad de inóculo en campo es imprescindible para la toma de decisiones relacionadas con el manejo de estas enfermedades.

Uno de los métodos utilizados para el seguimiento en campo del inóculo aéreo de hongos fitopatógenos es el sistema Burkard, que toma muestras de partículas en el aire por impacto en una cinta adhesiva, para su posterior cuantificación por observación de esporas en microscopio. Dada la complejidad de este proceso, las técnicas moleculares pueden suponer una alternativa eficaz para detectar e incluso cuantificar hongos en muestras ambientales.

El objetivo de este trabajo es poner a punto un protocolo de extracción, detección y cuantificación de P. chlamydospora mediante PCR anidada y PCR a tiempo real. Para ello, se utilizaron cintas con concentraciones conocidas de conidios obtenidos in vitro, así como muestras de cintas Burkard procedentes de campo.

En primer lugar, se preparó una solución madre con alta concentración de conidios (5 x 107 conidios/mL) procedente de P. chlamydospora cultivado in vitro y se realizaron diluciones seriadas hasta 10 conidios/mL. Sobre cintas impregnadas con silicona se aplicó una cantidad determinada de cada dilución y se procedió a la extracción de ADN.

Para la detección fue necesario el uso de una PCR anidada. En la primera reacción se amplificaron los Espaciadores Internos Transcritos (ITS) con cebadores universales de hongos. Los productos de PCR se utilizaron como molde en la PCR a tiempo real usando cebadores específicos de P. chlamydospora.

Para la aplicación del protocolo puesto a punto se expusieron portaobjetos con cintas siliconadas en diferentes viñedos localizados en Onteniente, Albacete y Requena. Cada semana se recogieron dos portaobjetos de cada viñedo y fueron sometidos a los métodos de extracción, PCR anidada y PCR a tiempo real previamente desarrollados.