Método para el genotipado de polimorfismo de único nucleótido relacionados con la administración del fármaco anticoagulante warfarina

Abstract

[EN] Oral anticoagulants are chronically taken by 1% and 2% of the population of the developed world. The most important is the warfarin (4-hydroxy-3-(3-oxo-1-phenylbutyl)-coumarin) because their effectiveness for thromboembolic prophylaxis in atrial fibrillation has been clinically demonstrated. However, warfarin is a drug with a wide interindividual variability and a narrow therapeutic index. Genetic markers have been proposed as stratification tools to predict therapeutic effects in patients. Therefore, pharmacogenetic tools brings potential ways for personalized therapeutic strategies that improve its efficacy and reduce harm of inaccurate doses. Relevant studies evaluating the impact of genetic variation on pharmacologic effects have been undertaken focused on warfarin in the last years. Unfortunately, the incorporation of these findings into health care systems is limited, being the cost-effectiveness the main drawback. Alternative methods to the extended genotyping technologies are required. The project objective is to develop a method for pharmacogenetic analysis of warfarin using genomic assays based on DNA microarrays. The research tasks are focused on achieving the genotyping of single base polymorphisms (SNPs). The studied SNPs are included in genes that codifies proteins, such as VKORC1 and CYP2C9, related to the metabolism and inactivation of such anti-coagulant drug. For that, allele specific amplification (ASA) is applied followed by using a detection procedure based on a portable, compact, robust, and versatile approach in microarray format. In addition, a blocking step is included for suppression of the erroneous-type allele and enrichment of the specific allele during amplification. The proposed method identify individuals who are at risk for poor therapeutic responses and is useful for amending treatment decisions. The categorization for each SNP as wild-homozygote, mutant homozygote or heterozygote, will support the prediction of an accurate warfarin dose for each patient, minimizing the threat of thromboembolism (underdosing) or bleeding (overdosing).

[ES] El 1-2% de la población del mundo desarrollado toma anticoagulantes orales de forma crónica. El más importante es la warfarina (4-hidroxi-3-(1-fenil-3-oxo-butil)-cumarina) porque se ha demostrado clínicamente su eficacia para la profilaxis tromboembólica en la fibrilación auricular. Sin embargo, la respuesta a la warfarina presenta una amplia variabilidad interindividual y su índice terapéutico es muy estrecho. En los últimos años se han llevado a cabo destacados estudios que evalúan el impacto de la variación genética en los efectos farmacológicos. Por lo tanto, las herramientas farmacogenéticas aportan vías potenciales para administrar estrategias terapéuticas personalizadas que mejoren su eficacia y reduzcan el daño generado por dosis incorrectas. Por desgracia, la incorporación de estos hallazgos en los sistemas de atención de salud es limitada, siendo el coste-efectividad el principal inconveniente. Por ello, se necesitan métodos alternativos a las tecnologías de genotipificación. El objetivo del proyecto es desarrollar un método para el análisis farmacogenético de la warfarina mediante ensayos genéticos basados en micromatrices de ADN. Las tareas de investigación están enfocadas a lograr el genotipado de polimorfismos de base única (SNP, single base polymorphism). Los SNPs estudiados se localizan en los genes que codifican proteínas, tales como VKORC1 y CYP2C9, relacionadas con el metabolismo y la inactivación de dicho fármaco anti-coagulante. Para ello, se aplica la amplificación alelo específica (ASA) seguida por el uso de un procedimiento de detección basado en formato de micromatrices con una aproximación portátil, compacta, robusta, y versátil. Además, se incluye durante la amplificación un paso de bloqueo para minimizar al máximo la amplificación del alelo erróneo maximizando así la amplificación específica de alelo. El método propuesto permite identificar a las personas con riesgo de presentar respuestas terapéuticas inapropiadas/inadecuadas y esútil para tomar las decisiones de tratamiento óptimo. De este modo, la categorización para cada SNP como homocigoto nativo, homocigoto mutante o heterocigoto, apoyará la predicción de la dosis de warfarina exacta para cada paciente, minimizando la amenaza de la enfermedad tromboembólica (infradosis) o sangrado (sobredosis).