SENSORES ENZIMATICOS COMO HERRAMIENTAS PARA EL CONTROL RAPIDO DE LA CALIDAD DE LA CARNE Y PRODUCTOS CARNICOS

Abstract

[EN] During the rippening of ham and dry sausages, biochemical changes are produced, the main changes are proteólisys, lipolisys, and glucolisys, that are going to define the quality that is normal in this type of products. The evaluation of certain components that are derivates of this reactions, can be used as markers of the process. This is the case of free amino acids like lysine, that is a marker of proteólisys, another example lactic acid, a product of glycogen fermentation, like a marker of correct fermentation carried out by lactic acid bacteria. Another way to assure the food quality is the addition of some ingredients like salt or additives like nitrate. Thus, nitrate after its trasformation in nitrite during the process has the capacity of inhibition of Clostridium botulinum, and its a helpers in the development of sensorial characteristcs like flavor, color and texture, specially in ferment meat. Although the nitrate is an necessary ingredient for assure food safety, must be according allowed levels, because can be potencially harmeful for health. There are different techniques for the analysis of those market of the process, being High Performance Liquid Chromatography (HPLC) the most used. However, this technique is expensive and not accesible for a food laboratory. The development of biosensors that use enzyme like and element of birecognition has achieved a great expansión in farmaceutical and sanitary industries. Those sensors combined the selectivity of enzymes with the selectivity of electrochemical detection. In addition are economic, easy to use and the measurement are fast and do not require specialized people. In this thesis our main objective is the possibility to use amperometric biosensors, comformed by an oximeter and an oxide reductase enzyme selected in function of the interest component that is going to be analyzed for monitoring the process. Thus, by the determination of lisine it has been choose the L-lisine alpha oxidase, for the determination of lactic acid, the lactate oxidase have been chosen and for the determination of nitrate, the nitrate reductase have been selected. Sensors have been optimized, for been used in a soluble and immobilized form. (For acid lactic sensor, just a soluble form has been developed) in all cases, the results of biosensor was compared with HPLC like reference method. Those sensors have been applied in real samples of ham and dry sausages allowing reliable determination of lysine, nitrate and lactic acid, with their respective enzymes.

[ES] Durante el proceso de curado del jamón y de los embutidos fermentados se producen cambios a nivel bioquímico entre los que destacan la proteólisis, la lipolisis y la glucolisis, y que van a definir la calidad que se espera en este tipo de productos. La evaluación de ciertos compuestos derivados de dichas reacciones, pueden servir como marcadores del proceso. Es el caso de los aminoácidos libres y en concreto la lisina como marcador de proteólisis, o el ácido láctico, producto de la fermentación de los carbohidratos como marcador de una fermentación adecuada de embutidos por bacterias acidolácticas. Por otro lado, la adición de algún ingrediente como la sal o aditivos como son los nitratos, van a asegurar la higiene del producto. Así, los nitratos tras su transformación en nitritos durante el proceso, tienen la capacidad de inhibir al Clostridium botulinum pero también colaboran en el desarrollo de las características sensoriales, aroma y color fundamentalmente, de los productos curados. Sin embargo, en este caso concreto, y a pesar de ser un ingrediente indispensable para asegurar sanitariamente el producto, debe mantenerse en niveles permitidos por ser potencialmente perjudicial para la salud. Existen diversas técnicas para el análisis de estos compuestos marcadores del proceso, siendo la más utilizada la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Sin embargo, esta técnica es cara, conlleva tiempo y no siempre resulta accesible para un laboratorio de una industria alimentaria. El desarrollo de biosensores en los que se utilizan enzimas como elemento de bioreconocimiento, ha alcanzado una gran expansión en algunos sectores como son la industria sanitaria y farmacéutica. Estos sensores combinan la selectividad de las enzimas con la sensibilidad de la detección electroquímica. Además, son de manejo sencillo, los análisis son rápidos, no requiere personal especializado, y es económico. En esta tesis nos planteamos pues la posibilidad de utilizar un biosensor amperométrico simple compuesto por un oxímetro y una enzima, que se seleccionará en función del compuesto clave que se quiera analizar para monitorizar los procesos. Así, para la determinación de lisina se ha elegido la lisina-¿-oxidasa, para la determinación de nitrato la nitrato reductasa, y para la determinación de ácido láctico la lactato oxidasa. Los sensores se han optimizado tanto para su uso con la enzima libre como inmovilizada en una membrana (en el caso del sensor de ácido láctico se desarrolló únicamente para la enzima libre) y en todos los casos se compararon los resultados de los biosensores con la cromatografía líquida de alta resolución como método de referencia. Estos sensores han sido aplicados a muestras reales de jamón y embutido curados permitiendo una determinación fiable de lisina, nitrato y ácido láctico con las respectivas enzimas.

[CA] Durant el procés de curat del pernil i dels embotits fermentats es produïxen canvis a nivell bioquímic entre els que destaquen la proteólisi, la lipolisi i glucòlisi, i que definiran la qualitat que s'espera en este tipus de productes. L'avaluació de certs compostos derivats de les dites reaccions, poden servir com a marcadors del procés. És el cas dels aminoàcids lliures i en concret la lisina com a marcador de proteólisi, o l'àcid làctic, producte de la fermentació dels carbohidrats com a marcador d'una fermentació adequada d'embotits per bacteris acidolácticas. D'altra banda, l'adició d'algun ingredient com la sal o aditius com són els nitrats, asseguraran la higiene del producte. Així, els nitrats després de la seua transformació en nitrits durant el procés, tenen la capacitat d'inhibir al Clostridium botulinum però també col·labora en el desenvolupament de les característiques sensorials, aroma i color fonamentalment, dels productes curats. No obstant això, en este cas concret, i a pesar de ser un ingredient indispensable per a assegurar sanitàriament el producte, ha de mantindre's en nivells permesos per ser potencialment perjudicial per a la salut. Hi ha diverses tècniques per a l'anàlisi d'estos compostos marcadors del procés, sent la més utilitzada la cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) . No obstant això, esta tècnica és cara, comporta temps i no sempre accessible per a un laboratori d'una indústria alimentària. El desenvolupament de biosensors en què s'utilitzen enzims com a element de biorecoeixement, ha aconseguit una gran expansió en alguns sectors com són la indústria sanitària i farmacèutica. Estos sensors combinen la selectivitat dels enzims amb la sensibilitat de la detecció electroquímica. A més, són de maneig senzill, les anàlisis són ràpides, no requerix personal especialitzat, i és econòmic. En esta tesi ens plantegem la possibilitat d'utilitzar un biosensor amperométrico simple compost per un oxímetre i un enzim, que se seleccionarà en funció del compost clau que es vullga analitzar per a monitoritzar els procesos. Així, per a la determinació de lisina s'ha triat la lisina-oxidasa, per a la determinació de nitrat la nitrat reductasa, i per a la determinació d'àcid làctic la lactat oxidasa. Els sensors s'han optimitzat tant per al seu ús amb l'enzim lliure com immobilitzada en una membrana (en el cas del sensor d'àcid làctic es va desevolupar únicament per a l'enzim lliure) i en tots els casos es van comparar els resultats dels biosensors amb la cromatografia líquida d'alta resolució com a mètode de referència. Estos sensors han sigut aplicats a mostres reals de pernil i embotit curats permetent una determinació fiable de lisina, nitrat i àcid làctic amb els respectius enzims.