ZEBRAFISH AS BIOINDICATOR OF EPIGENETIC FACTORS PRESENT IN DRINKING WATER THAT MAY AFFECT DEVELOPMENT AND REPRODUCTIVE FUNCTION

Abstract

[EN] Emerging organic pollutants include a wide array of different compounds. The main characteristic of these numerous substances is that they do not need to be persistent in the environment to cause negative effects, since their high transformation and removal rates can be offset by their continuous introduction into the environment. One of the main sources of these contaminants is untreated urban wastewaters and wastewater treatment effluents. Most current wastewater treatment plants are not designed to treat these types of substances, for that reason a high portion of these pollutants can escape and enter to the urban water cycle reaching, therefore, the drinking water supply. The problem is exacerbated by the fact that many of these compounds are non-regulated. For the same reason, although concentrations are generally low (ng/l- µg/l), there are worries about their potential and unknown risks of exposures. In this sense, it is known that emerging organic pollutants can have long-lasting effects on development and reproduction, sometimes even in subsequent generations, via epigenetic mechanisms or by mutagenic effects. For all the above reasons, bioindicators such as fishes can be used as an alternative, at least complementary, to monitor their presence. In this sense, in the present thesis was studied whether zebrafish could be established as a bioindicator to detect the presence of these substances in drinking waters through the study of the effects on development and, especially, on reproduction. To accomplish this objective, four studies were carried out. Firstly, it was compared whether keeping the chorion intact or, on the contrary, permeabilized with pronase with the aim to figure out if the chorion acts as a barrier to emerging pollutants. Results from this study suggest using embryos with the chorion intact from the outset when drinking water from different sources was to be tested. In the second study were defined and narrowed down the most sensitive biological parameters to detect the effects of emerging organic pollutants on the development and, especially, on the zebrafish reproduction. Results showed that the hatching, fertility and underdeveloped rates were the most sensitive parameters. In the third study was analyzed the possible cumulative effect along two generations and/or the possible reversibility of the effects from emerging organic pollutants in zebrafish specimens reared in drinking water. Results showed a non-reversible effect on fertility rate and an alteration of sex ratio towards females in one of the studied water, although in this last case the alteration was reversible. A transgenerational alteration in the germline via epigenetic mechanism from the previous generation is proposed as the most plausible explanation to this effect. Finally, it was developed the fourth study with the aim to discriminate the effects from organic pollutants through three different pathways: male, female or water where the fertilization took place. Results showed a decrease in the fertility rate and in the hatching rate, due to an effect of the water where fertilization took place.The most plausible explanation could be the presence of substances which affect the micropyle and chorion. In addition, it was observed a decrease in the fertility rate due to a female effect, but in this case by an alteration of the oocyte quality. Taking into account the results obtained, it could be stated that the zebrafish is a suitable bioindicator to detect the effects from organic pollutants at very low concentration, when are reared in drinking water throughout their life-cycle.

[ES] Los contaminantes orgánicos emergentes incluyen una amplia gama de compuestos diferentes. La principal característica de estas numerosas sustancias es que no necesitan ser persistentes en el medio para causar efectos negativos, ya que sus altas tasas de transformación y eliminación pueden ser compensadas por su continua introducción en el medio ambiente. Una de las principales fuentes de estos contaminantes son las aguas residuales urbanas no tratadas y los efluentes de tratamiento de aguas residuales. La mayoría de las plantas de aguas residuales actuales no están diseñadas para el tratamiento de este tipo de sustancias, por ello una alta porción de estos contaminantes pueden escapar y entrar al ciclo urbano del agua alcanzando, por lo tanto, el suministro de agua potable. El problema se agrava porque muchos de estos compuestos no están regulados. Por la misma razón, aunque las concentraciones son generalmente bajas (ng/l- µg/l), se desconocen los posibles riesgos a la exposición de estos compuestos. Por otro lado, se sabe que los contaminantes orgánicos emergentes pueden tener efectos a largo plazo sobre el desarrollo y la reproducción, a veces incluso en las generaciones posteriores, a través de mecanismos epigenéticos y/o por efectos mutagénicos. Por todas las razones citadas anteriormente, los bioindicadores como los peces pueden ser usados como una alternativa, al menos complementaria, para controlar su presencia. En este sentido, en la presente tesis se estudió si el pez cebra se podría establecer como bioindicador para detectar la presencia de estas sustancias en aguas potables a través del estudio de los efectos sobre el desarrollo y, en especial, sobre la reproducción. Para lograr este objetivo, se llevaron a cabo cuatro estudios. En primer lugar, se comparó mantener el corion intacto o, por el contrario, permeabilizarlo con pronasa para averiguar si el corion actúa como una barrera a los contaminantes emergentes. Los resultados de este estudio sugieren el uso de embriones con el corion intacto desde el principio, cuando va a ser usada agua potable procedente de diferentes orígenes. En el segundo estudio se definieron y acotaron los parámetros biológicos más sensibles para detectar los efectos de los contaminantes orgánicos emergentes sobre el desarrollo y sobre la reproducción del pez cebra. Los resultados mostraron que los parámetros más sensibles fueron la tasa de eclosión, la tasa de fecundidad y la tasa de especímenes subdesarrollados. En el tercer estudio fue analizado el posible efecto acumulativo a lo largo de dos generaciones y/o la posible reversibilidad de los efectos de los contaminantes orgánicos en especímenes de pez cebra criados en aguas potables. Los resultados mostraron un efecto irreversible en la tasa de fecundidad y una alteración de la proporción sexual hacia hembras en una de las aguas estudiadas, aunque en este último caso la alteración fue reversible. Una alteración transgeneracional en la línea germinal a través de mecanismos epigenéticos de la generación anterior se propone como la explicación más plausible para este efecto. Finalmente, se desarrolló el cuarto estudio con el objetivo de discriminar los efectos de los contaminantes orgánicos a través de tres vías diferentes: macho, hembra o agua donde la fertilización se llevó a cabo. Los resultados mostraron una disminución de la fertilidad y la tasa de eclosión, debido a un efecto del agua donde la fertilización tuvo lugar. La explicación más plausible podría ser la presencia de sustancias que afectan al micropilo y al corion. Además, se observó una disminución en la tasa de fertilidad debido a un efecto hembra, pero en este caso por una alteración de la calidad de los ovocitos. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se puede afirmar que el pez cebra es un bioindicador adecuado para detectar los efectos de los contaminantes orgánicos en concentraciones muy bajas, cuando

[CA] Els contaminants orgànics emergents inclouen una àmplia gamma de compostos diferents. La principal característica d'aquestes nombroses substàncies és que no necessiten ser persistents en el medi per causar efectes negatius, ja que les seves altes taxes de transformació i eliminació poden ser compensades per la seva contínua introducció en el medi ambient. Una de les principals fonts d'aquests contaminants són les aigües residuals urbanes no tractades i els efluents de tractament d'aigües residuals. La majoria de les plantes d'aigües residuals actuals no estan dissenyades per al tractament d'aquest tipus de substàncies, per això una alta porció d'aquests contaminants poden escapar i entrar al cicle urbà de l'aigua aconseguint, per tant, el subministrament d'aigua potable. El problema s'agreuja perquè molts d'aquests compostos no estan regulats. Per la mateixa raó, encara que les concentracions són generalment baixes (ng/l- µg/l), es desconeixen els possibles riscos a l'exposició d'aquests compostos. D'altra banda, se sap que els contaminants orgànics emergents poden tenir efectes a llarg termini sobre el desenvolupament i la reproducció, de vegades fins i tot en les generacions posteriors, a través de mecanismes epigenetics i/o per efectes mutagenètics. Per totes estes raons, els bioindicadors com els peixos poden ser usats com una alternativa, almenys complementària, per controlar la seva presència. En aquest sentit, en la present tesi es va estudiar si el peix zebra es podria establir com a bioindicador per detectar la presència d'aquestes substàncies en aigües potables a través de l'estudi dels efectes sobre el desenvolupament i, especialment, sobre la reproducció. Per aconseguir aquest objectiu, es van dur a terme quatre estudis. En primer lloc, es va comparar mantenir el cori intacte o, per contra, permeabilitzar-lo amb pronasa per esbrinar si el cori actua com una barrera als contaminants emergents. Els resultats d'aquest estudi suggereixen l'ús d'embrions amb el cori intacte des del principi, quan va a ser usada aigua potable procedent de diferents orígens. En el segon estudi es van definir i van fitar els paràmetres biològics més sensibles per detectar els efectes dels contaminants orgànics emergents sobre el desenvolupament i sobre la reproducció del peix zebra. Els resultats van mostrar que els paràmetres més sensibles van ser la taxa d'eclosió, la taxa de fecunditat i la taxa d'espècimens subdesenvolupats. En el tercer estudi es va analitzar el possible efecte acumulatiu al llarg de dues generacions i/o la possible reversibilitat dels efectes dels contaminants orgànics emergents en espècimens de peix zebra criats en aigües potables. Els resultats van mostrar un efecte irreversible en la taxa de fecunditat i una alteració de la proporció sexual cap a femelles en una de les aigües estudiades, encara que en aquest últim cas l'alteració va ser reversible. Una alteració transgeneracional en la línia germinal a través de mecanismes epigenètics de la generació anterior es proposa com l'explicació més plausible per a aquest efecte. Finalment, es va desenvolupar el quart estudi amb l'objectiu de discriminar els efectes dels contaminants orgànics a través de tres vies diferents: mascle, femella o aigua on la fertilització es va dur a terme. Els resultats van mostrar una disminució de la fertilitat i la taxa d'eclosió, a causa d'un efecte de l'aigua on la fertilització va tenir lloc. L'explicació més plausible podria ser la presència de substàncies que afecten al "micropilo" i al cori. A més, es va observar una disminució en la taxa de fertilitat a causa d'un efecte femella, però en aquest cas per una alteració de la qualitat dels ovòcits. Tenint en compte els resultats obtinguts, es pot afirmar que el peix zebra és un bioindicador adequat per detectar els efectes dels contaminants orgànics en concentracions molt baixes, quan es crien en l'aigua potable