Deformaciones en pino relacionadas con ''Candidatus Phytoplasma pini' en la Comunidad Valenciana

Abstract

[EN] In pine forest of Comunidad Valenciana region, abnormal symptoms that could be associated with infection by phytoplasma, were observed in several Aleppo pine (Pinus halepensis). Five types of disorders were identified: Trees showing a branch with dense balllike appearance (Rama Bola), trees showing all his treetop with dense appearance, stunted and needles shorter than usual (Arbol Bola), trees showing aberration on terminal branches and twisty needles (Deformacion), trees with yellowing needles (Puntisecado) and trees with defined sectors of the treetop with dry needles (Fogonazo). The aim of the present study was to detect, using molecular techniques, the possible presence of phytoplasmas in symptomatic and asymptomatic pines, besides studying the possible transmission of these pathogens by seed and by grafting. For this purpose different methods of processing and extraction of samples for analysis by nested-PCR with universal primers for phytoplasmas P1/P7 followed R16F2n/R2 were compared, determining the most suitable combination for these samples is manual crushing hammer followed by extraction of DNA using the commercial kit EZNATM. From June 2011 to January 2014 pines were sampled at different times, 50 symptomatic and 83 asymptomatic located in the surroundings of the affected ones. Phytoplasma were detected in 12 pine trees: 3 with symptoms of “Rama Bola”, 2 “Árbol Bola”, 2 with “Deformación”, 2 with “Fogonazo”and 3 showing symptoms of “Puntisecado”. No phytoplasma was detected from non-syntomatic trees. Simultaneously seeds taken from 6 symptomatic trees were sown and needles and roots of 102 seedlings obtained were analyzed, but seed transmission was not confirmed. In the trial of graft transmission it could not be obtained conclusive results because none of the grafts seized. Identification of phytoplasma isolates detected during the assay were performed using two techniques: RFLP analysis of the 16S rDNA gene with restriction enzymes Taql, AluI, TruI, RsaI and HinfI and by sequencing of the PCR products obtained in the nested and subsequent BLAST analysis comparing sequences deposited in the NCBI Genbank. Both methods revealed that the phytoplasma detected in 12 positive pines was 'Candidatus Phytoplasma pini' belonging to the group 16SrXXI.

[ES] En pinares de la Comunidad Valenciana se venían observando algunos pies de pino carrasco (Pinus halepensis) con síntomas anómalos que podrían asociarse con una infección por fitoplasmas. Se observaron cinco tipos de desarreglos: árboles que mostraban una rama con aspecto de bola densa (Rama Bola), árboles que presentaban toda su copa con aspecto denso, retraso en el crecimiento y acículas más cortas de lo habitual (Árbol Bola), árboles con deformaciones en ramas terminales y acículas reviradas (Deformaciónes), árboles con amarilleo en acículas (Puntisecado) y árboles con sectores definidos de su copa con acículas secas (Fogonazo). En el presente estudio se planteó detectar mediante técnicas moleculares la posible presencia de fitoplasmas en pinos que mostraran síntomas y en pinos asintomáticos, además de estudiar la posible transmisión de estos patógenos por semilla y mediante injerto. Para ello se compararon distintos métodos de procesado y de extracción de las muestras para su posterioranálisis mediante nested-PCR con los primers universales para fitoplasmas P1/P7 seguidos de R162F2n/R2, determinándose que la combinación más adecuada para este tipo de muestras es el triturado manual con maza seguido de la extracción de DNA mediante el Kit comercial EZNATM. Entre junio de 2011 y enero de 2014 se muestrearon en distintas fechas 50 pies sintomáticos y 83 asintomáticos situados en los entornos de los árboles afectados, detectándose fitoplasmas en 12 de los pies: 3 con síntomas de Rama Bola, 2 Árbol Bola, 2 con Deformaciones, 2 con Fogonazo y 3 con síntoma de Puntisecado. No se detectó fitoplasmas en pies asintomáticoss. Simultáneamente se realizó la siembra de semillas tomadas de 6 árboles sintomáticos y se analizaron acículas y raices de las 102 plántulas obtenidas, pero no se pudo confirmar su transmisión por semilla. En el ensayo de transmisión por injerto tampoco se obtuvieron resultados concluyentes ya que ninguno de los injertos prendieron. La identificación de los aislados de fitoplasmas detectados se realizó usando dos técnicas: análisis RFLP del gen 16S rDNA con las enzimas de restricción TaqI, AluI, truI, RsaI y HinfI y mediante secuenciación de los productos obtenidos en la nested PCR y posterior análisis BLAST comparando secuencias depositadas en el Genbank del NCBI. Ambos métodos revelaron que el fitoplasma detectado en los 12 individuos positivos se trataba de ‘Candidatus Phytoplasma pini’ perteneciente al grupo 16SrXXI