Comprobación de la especificidad de los interactores del canal de potasio KAT1 de Arabidopsis thaliana identificado por el sistema Split-ubiquitina

Abstract

[ES] La homeostasis del ion potasio es clave para la supervivencia y el crecimiento de los seres vivos. El flujo de entrada de este ion en la célula está regulado por unos canales localizados en su membrana plasmática. Dada la gran importancia de su correcto funcionamiento estos transportadores se encuentran altamente regulados. En este proyecto nos hemos centrado en dos canales de potasio prototipo: el canal rectificador de entrada KAT1 de Arabidopsis thaliana y el trasportador de alta afinidad de potasio de Saccharomyces cerevisiae Trk1. El canal rectificador de entrada KAT1 pertenece a la familia Shaker y participa en la apertura y el cierre de estomas. Por esta razón su regulación es fundamental para la resistencia de la planta al estrés hídrico. En estudios anteriores utilizando el ensayo de interacción proteína-proteína Split-Ubiquitin nuestro grupo identificó 18 genes de A. thaliana cuyas proteínas interaccionan físicamente con KAT1. Sin embargo, para confirmar la especificidad de estas interacciones son necesarios más análisis. Con este objetivo, el fin de este trabajo consistió en detectar entre estos 18 interactores posibles falsos positivos. Los falsos positivos pueden aparecer cuando las proteínas bait y las prey se acumulan en compartimentos intracelulares dando lugar a la activación inespecífica del sistema. Por ello, los análisis realizados para su detección consistieron en repetir el análisis de interacción proteína-proteína Split-Ubiquitin con las 18 proteínas candidatas utilizando la subunidad gamma del complejo oligosacariltransferasa de levadura, Ost3, como proteína bait. Con este ensayo se identificaron como falsos positivos tres de las proteínas candidatas debido a su interacción con la proteína Ost3, la cual no está relacionada con ellas. Éstas fueron descartadas para futuros análisis. Pero, lo que es más importante, se confirmó la especificidad con KAT1 de 13 de ellas. Con éstas se llevarán a cabo futuros ensayos en planta para determinar si son verdaderas reguladoras de KAT1. El otro objetivo fue generar herramientas para poder aplicar el análisis de interacción proteínaproteína Split-Ubiquitin al transportador de potasio de levadura Trk1 y al homólogo de KAT1, KAT2. En este trabajo se describe la construcción de los plásmidos bait para estos dos transportadores mediante recombinación en levadura. Con los plásmidos generados se realizó un análisis funcional inicial con el fin de comprobar que eran adecuados para próximos estudios. Entre estos estudios se incluyen rastreos propios para la identificación de posibles interactores. A pesar de que en KAT2 no observamos actividad como transportador ni capacidad de dimerizar en este sistema, sí que observamos que Trk1 era funcional e interaccionaba consigo mismo. Este resultado, aunque preliminar, es la primera confirmación experimental de la tetramerizacón de Trk1 propuesta por Guy y Durell en 1999.

[EN] Potassium homeostasis is crucial for survival and development of essentially all living organisms. Inward fluxes of this ion are mediated by channels located in the plasma membrane. Due to the importance of the correct operation of these transporters, they are highly regulated. In this project, we have focused on two prototypic potassium channels: the rectifying inward cannel KAT1 from Arabidopsis thaliana and the Trk1 high affinity potassium transporter from Saccharomyces cerevisiae. The inward rectifying channel, KAT1 belongs to the Shaker family and its activity participates in stomatal opening and closing. For this reason its regulation is proposed to be fundamental for plant drought resistance. In previous studies using the Split-Ubiquitin protein-protein interaction assay, our group has identified 18 A. thaliana genes whose proteins interact physically with KAT1. However, in order to confirm the specificity of these interactions it is necessary to carry out further analyses. To this end, in this project our aim was to identify possible false positives among the 18 clones we identified. False positives may arise in cases where the prey and bait proteins artifactually accumulate in intracellular compartments leading to non-specific activation of the system. The analysis presented here consisted of repeating Split-Ubiquitin protein-protein interaction analysis with the 18 candidate clones using the gamma subunit of the yeast oligosaccharyltransferase complex, Ost3 as the bait protein. Three candidate proteins that interact with the unrelated Ost3 bait protein were identified as false positives and will be discarded from future analyses. But, more importantly, the specificity of 13 was confirmed. These proteins will be the subject of further studies in plants to determine if they are bona fide KAT1 regulators. In addition, we aimed to generate tools to apply the Split-Ubiquitin protein-protein interaction assay to the Trk1 yeast potassium transporter and the KAT1 homologue, KAT2. Here, we describe the construction of the bait vectors for both transporters using in vivo recombination in yeast. We performed an initial analysis of the function of these newly generated plasmids to determine whether they are appropriate for further studies including library screenings to identify novel interactors. Although we failed to observe KAT2 transport activity or dimerization in this system, we did observe that Trk1 is functional and that is interacts with itself. This observation, although preliminary, is the first experimental confirmation of the tetramerization of Trk1 proposed by Durell and Guy in 1999.