Búsqueda de interactores de QQS, proteína de un gen huérfano de Arabidopsis que está relacionada con el pH intracelular y el metabolismo de almidón, mediante dos técnicas de Doble Híbrido

Abstract

[ES] Datos previos de microarray de los mutantes simples de pérdida de función de las dos principales isoformas de la H+-ATPasa, aha1-6 y aha2-4, ponen en evidencia QQS, él único gen que baja sensiblemente su expresión en ambos mutantes (Haruta et al., 2012). Además, nuestras primeras investigaciones de la línea transgénica pQQS::QQS-GFP de Arabidopsis tratadas a distintos pHs, nos indican que QQS varía mucho su expresión: aumenta en ambientes alcalinos y desaparece su señal en ambientes ácidos. Por último, nuestros western blots (con anticuerpos contra la H+ATPasas) de la línea de QQS RNAi, comparados con los adecuados controles, indican que QQS puede ser un factor directo o indirecto de la inhibición de la expresión de la H+ATPasa. Este gen, que codifica para una pequeña proteína citosolica de 59 aminoacidos, no presenta dominios conocidos y está presente solo en las especies de Arabidopsis y Brassica rapa (Li et al., 2009). Para seguir la investigación adelante, queremos descubrir cuáles son sus dianas mediante la técnica de rastreo de doble híbrido contra una biblioteca de cDNA de Arabidopsis (Németh et al., 1998). Clonaremos el gen QQS en un plásmido para usarlo de cebo o "bait" y se trasformará en levadura, para luego realizar el rastreo de proteínas que interaccionan con la nuestra a partir de la biblioteca de cDNA. Tampoco podemos excluir que QQS pueda interaccionar directamente con la H+-ATPasa, por lo que probaremos como control positivo solo la zona C terminal de la bomba protónica. También se realizará un doble híbrido específico para proteínas de membranas (sistema de la compañia Dualsystem Biotech). Hay evidencias en nuestro laboratorio, que líneas de perdida de función de 14-3-3 de Arabidopsis, presenten un nivel de expressión de la H+-ATPasa más bajo, no obstantes estos genes no codifiquen para factores de transcripción. En este tipo de doble híbrido usaremos AHA2 como bait y QQS como prey. Mientras un gen de la familia 14-3-3, lo emplearemos de prey para ser nuestro control positivo. Los resultados pueden darnos la clave para descubrir un nuevo mecanismo que controla la H+-ATPasa y su efecto en el pH intracelular.

[EN] Previous data from microarrays of the simple knock-out mutants of the main isoforms of PM H+ - ATPase, aha1-6 and aha2-4, evidence that QQS is the only gene which is downregulated in both cases. Additionally, expression data from our laboratory suggests that QQS is antagonistic with respect to PM H+ -ATPases. In order to support these results, the expression of QQS was assessed with fluorescence microscopy at different pH values in the Arabidopsis transgenic line pQQS::QQS-GFP. The results showed an increase of the expression at basic pH values, whereas the fluorescence disappeared at acidic values. Furthermore, the QQS RNAi line was Western blotted using different antibodies against the PM H+ - ATPase, showing that QQS may act as a direct or indirect inhibitor of the expression of PM H+ - ATPases. QQS encodes for a small cytosolic protein of only 59 amino acids, does not show any known domains and is not present in closely related species such as Arabidopsis lyrata or Brassica napus. To investigate its targets, a yeast-two hybrid screening was carried out against an Arabidopsis cDNA library. QQS was cloned in a bait plasmid and was co-transformed with the cDNA library in yeast to perform the screening. The most promising interacting protein is At1g70470, a membrane protein of unknown function and without any bibliographic information. As a direct interaction between QQS and PM H+ -ATPase could not be excluded, a specific yeast-two hybrid assay for membrane proteins was conducted. In this case, the PM H+ -ATPase AHA1 was used as bait, while QQS was the prey protein. The results proved that both proteins interact directly, providing a new control mechanism of the PM H+ -ATPases and intracellular pH.