Estudio de la regulación de la homeostasis de hierro por la ruta del control general de aminoácidos en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

[ES] Los aminoácidos son uno de los nutrientes más importantes para las células, lo que ha supuesto que estas hayan desarrollado complejos mecanismos para regular su homeostasis, siendo los más importantes en levadura la ruta TOR y la ruta GAAC. El hierro también es un nutriente esencial, ya que forma parte de multitud de enzimas cuya actividad es dependiente de este metal, entre ellas algunas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos. Por ello parece lógico que la regulación del metabolismo de aminoácidos y la del hierro guarden relación. Trabajos previos en el laboratorio demostraron que la ruta GAAC, cuyo elemento central es la quinasa Gcn2, controla la expresión del regulón de hierro modulando la localización subcelular del factor de transcripción Aft1. El objetivo de este trabajo es profundizar en el estudio de la relación entre la ruta GAAC y la regulación de la homeostasis del hierro y comprobar si dicha relación está asociada a una modulación de la síntesis de complejos Fe/S. Para ello se estudió la localización subcelular del factor de transcripción Aft1 unido a GFP y se vio que el tratamiento con aminoácidos provoca su localización citoplasmática. Por otro lado, el análisis de la velocidad de toma de hierro en el mutante de pérdida de función de GCN2 y en el mutante con el alelo de GCN2 constitutivamente activo indicó que las diferencias a nivel de expresión de los transportadores de hierro, observadas anteriormente en el laboratorio, tienen influencia a nivel de proteína. Con el objetivo de comprobar si la regulación de la ruta GAAC sobre Aft1 se produce a través de una modulación de la síntesis de los complejos Fe/S, se realizó un ensayo de la actividad aconitasa en células tratadas con aminoácidos, el cual mostró un aumento de la actividad de esta enzima, lo que explica que la localización de Aft1 en las células tratadas sea mayoritariamente citosólica y por tanto, que el regulón de hierro esté reprimido. Por otro lado, el descenso de la actividad aconitasa en el mutante Δgcn2 no correspondió con lo esperado, lo que cuestiona la hipótesis de que la regulación del regulón de Aft1 por la ruta GAAC se produzca a través de una modulación de la síntesis de los complejos Fe/S. Por último, se llevó a cabo el análisis de la expresión del regulón de hierro en los mutantes Δaft1 y GCN2c bajo tratamiento con aminoácidos. Los resultados obtenidos indican, por un lado, que los aminoácidos regulan esta expresión principalmente a través de Aft1, y en segundo lugar, que probablemente existan otras rutas, además de GAAC, que regulan la homeostasis de hierro en respuesta a aminoácidos. Estos estudios realizados en levadura sirven como modelo para organismos eucariotas más complejos, donde los mecanismos que regulan la homeostasis de aminoácidos y de hierro están conservados

[EN] As amino acids are one of the most important nutrients for cells, these have evolved complex mechanisms to regulate their homeostasis. In yeast and higher eukaryotes these mechanisms include the TOR and GAAC pathways. Iron is also an essential nutrient, since it is part of several iron-dependent enzymes, some of them involved in amino acid biosynthesis. Therefore it can be expected that the regulation of both, amino acid and iron metabolism, is somehow related. Previous studies in our laboratory demonstrated that the GAAC pathway, whose central element is the kinase Gcn2, controls the expression of the iron regulon modulating the subcellular localization of Aft1 transcription factor. The objective of this project is to study more in depth the relation between the GAAC pathway and the iron homeostasis regulation and to ascertain if this relation is associated with a modulation of Fe/S cluster synthesis. The subcellular localization of an Aft1-GFP fusion protein revealed that an amino acid treatment triggers its cytoplasmic localization. Secondly, the iron uptake rate analysis in a GCN2 loss-of-function mutant and in a mutant containing a constitutively active allele of GCN2 indicated that differences in the expression of iron transporters genes, which were previously determined in our laboratory, correlate with differences at the protein level. With the aim to find out if the GAAC pathway-mediated regulation of Aft1 is due to a modulation of Fe/S cluster synthesis, we performed an aconitase activity assay with amino acid treated cells, which showed an increase in their enzyme activity. This can explain the cytoplasmic localization of Aft1 in amino acid treated cells and the repression of the iron regulon. Unexpectedly, aconitase activity decreased in Δgcn2 mutant cells, which argues against Fe/S clusters serving as signal in the GAAC pathway-mediated regulation of Aft1. Finally, we analyzed the effect of an amino acid treatment on iron regulon expression in both Δaft1 and GCN2c mutant cells. The results indicate that amino acids regulate the iron regulon expression mainly through Aft1. Furthermore, these findings suggest that probably other pathways, in addition to GAAC, regulate iron homeostasis in response to amino acids. These studies in yeast can be used as a model for more complex eukaryotic organisms, where mechanisms that regulate amino acid and iron homeostasis are highly conserved.