Desarrollo de metodologías de anclaje de anticuerpos basadas en reacciones de click-chemistry. Aplicación a la detección de marcadores cardíacos

Abstract

[ES] La detección temprana de enfermedades muchas veces se basa en la medición de una o varias proteínas y/o en el análisis genético. El formato microarray es un buen candidato para aplicarlo a los dispositivos de detección porque posee una gran capacidad de trabajo y poco consumo de reactivos y muestra. Sin embargo existen otras aproximaciones para el desarrollo de dispositivos PoC también interesantes, como son las tecnologías basadas en nanobiosensado óptico. En ambos formatos la inmovilización del receptor es crucial en las prestaciones del ensayo final. Tradicionalmente, la inmovilización covalente ha sido la mejor considerada, por su robustez y fiabilidad. En este trabajo se propone el estudio de métodos de inmovilización, en soportes planos y en formato microarray, de fragmentos Fab de anticuerpos (previamente generados y purificados) mediante el empleo de reacciones, inducidas por luz basadas en click-chemistry. El trabajo plantea como objetivos la funcionalización y caracterización de las superficies, el desarrollo de la metodología de escisión de los anticuerpos, y el estudio de distintas aproximaciones de anclaje de Fabs inducidas por luz y de su biodisponibilidad una vez inmovilizados. El objetivo final será su aplicación a la detección de marcadores cardíacos (CRP, troponina, etc¿) utilizando un transductor basado en nanosensado óptico.

[EN] This project is framed in the European Project PHOCNOSIS (H2020-PHC-634013), which aims the development of a point-of-care (POC) analytical device. It is based in many nanotechnology novel concepts, for its application in the early diagnosis of cardiovascular diseases. The diagnosis will be carried out by means of the fast (<10 minutes), ultra-sensitive (<1 ng/L) and label-free detection of multiple cardiac biomarkers, using a small volume of whole blood (<100 μL). To achieve this goal, one of the main steps is the development of suitable methods for the immobilization of specific receptors (antibodies) for the targeted cardiac biomarkers. This immobilization must be oriented and selective in the sensor areas of the chip, and although it must allow that the biorecognition takes place as close as possible to the surface. The assignment presents the anchorage methodology improvement of the bioreceptors to the material that establish the nanophotonic-based device. These approaches are based in the photoimmbilization using click-chemistry reactions (thiol-ene reactions). The whole work was done using a fluorescence microarray methodologies and two model systems. In this way, the first biosensor is based on BSA (bovine serum albumin)-αBSA system as polyclonal antibody model. Many parameters have been optimized as the antibody fragment to be anchored, the irradiation time and the detection method. According to project’s goal, many similar experiments have been performed with the monoclonal system CRP (C-reactive protein)-αCRP, as in the final device the bioreceptors will be monoclonal antybodies.