Micropartículas poliméricas con nanopartículas magnéticas para la estimulación mecánica de células mesenquimales: síntesis y viabilidad celular

Abstract

[ES] El objetivo de este trabajo ha sido la preparación, caracterización y estudio de la viabilidad celular de matrices extracelulares sintéticas formadas por micropartículas poliméricas que responden a campos magnéticos en el seno de un hidrogel natural, para la estimulación local de células en aplicaciones de ingeniería tisular. Las micropartículas han sido preparadas de ácido poliláctico y se han cargado de nanopartículas de ferrita para su estimulación magnética. El soporte de hidrogel ha consistido en una matriz de gelatina inyectable, que ha permitido la encapsulación de células y micropartículas en el momento de su entrecruzamiento. Se ha llevado a cabo la fabricación de las microesferas y se ha analizado su topografía mediante microscopía de barrido de emisión de campo. La incorporación de las nanopartículas magnéticas afecta a la cristalinidad de las microesferas, suponiendo un aumento en la cristalinidad de las mismas. Se ha comprobado que las microesferas presentan dimensiones entorno al tamaño celular y poseen magnetización. En cuanto al hidrogel, se ha obtenido gelatina modificada con tiramina para posibilitar la reticulación del mismo mediante una reacción enzimática mediada por la adición secuencial de peroxidasa y peróxido de hidrógeno y se ha medido el grado de injerto logrado en el proceso. Mediante el uso de reómetro se ha determinado el tiempo de gelificación de dicha matriz. Se han llevado a cabo ensayos biológicos con dos líneas celulares, fibroblastos L929 y preosteoblastos MC3T3-E1, con el objetivo de caracterizar la viabilidad y proliferación celular asociada a los materiales desarrollados. Mediante ensayos de LIVE/DEAD se ha observado que los hidrogeles no presentan efectos citotóxicos a corto plazo cuando se emplean para encapsulación celular. Los estudios de proliferación demuestran que hasta 7 días de cultivo in vitro se mantiene la viabilidad y existe proliferación. Finalmente, mediante una tinción celular Actina/DAPI se ha podido observar la morfología 3D de células cultivadas en los hidrogeles con microesferas, determinándose que éstas adaptan su citoesqueleto de actina al ser cultivadas en el sistema planteado. Por todo ello, los hidrogeles con microesferas desarrollados presentan un gran potencial para su uso en el campo de la medicina regenerativa, ya que no comprometen la viabilidad ni la proliferación celular y constituyen un entorno biomimético prometedor para lograr la diferenciación ósea, por su potencial capacidad de transmitir estímulos mecánicos a las células encapsuladas en los mismos.

[EN] The aim of this project has been the preparation, characterization and study of cell viability of extracellular synthetic matrices formed by polymeric microparticles which respond to magnetic fields within a natural hydrogel, for the local stimulation of cells in tissue engineering applications. The microparticles have been prepared of polylactic acid and loaded with ferrite nanoparticles for its magnetic stimulation. The hydrogel support has consisted of a matrix of injectable gelatin, which has allowed cells and microparticles encapsulation in the time of crosslinking. The production of the microspheres has been carried out and its topography has been analyzed by scanning field emission microscopy. The incorporation of magnetic nanoparticles affects the crystallinity of the microspheres, resulting in an increase of its crystallinity. The microspheres have dimensions around the cell size and have magnetization. For the hydrogel, gelatin modified with tyramine has been obtained, in order to enable its crosslinking by an enzymatic reaction mediated by the sequential addition of peroxidase and hydrogen peroxide. The degree of grafting achieved in the process has been measured. Using a rheometer, the gelling time of that matrix has been determined. In vitro cultures have been carried out with two cell lines, fibroblasts L929 and MC3T3- E1 pre-osteoblasts, with the aim of characterizing the cell viability and proliferation associated with the materials developed. LIVE / DEAD essay has shown that hydrogels have no short term cytotoxic effects when used for cell encapsulation. Proliferation studies have demonstrated that up to 7 days of in vitro culture, cell viability is maintained and proliferation exists. Finally, by cell staining Actin / DAPI the 3D morphology of cells cultured within the hydrogels containing microspheres has been observed, being shown that cells adapt their actin cytoskeleton when grown in the proposed system. Therefore, the developed hydrogels with microspheres have great potential in the field of regenerative medicine, as they do not compromise the viability or cell proliferation. These hydrogels represent a promising environment to achieve biomimetic bone differentiation because of their potential ability to transmit mechanical stimuli to the cells encapsulated in them.