Interacción con ligandos celulares de los dominios SH3 del adaptador CIN85 en la regulación del EGFR

Abstract

[ES] Relevancia del EGFR El receptor del Factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es un receptor del tipo tirosina quinasa (RTK). La interacción con su ligando natural (el Factor de crecimiento epidérmico, EGF) es la responsable de una amplia variedad de procesos biológicos importantes como la proliferación celular, la diferenciación, la supervivencia, la migración, la adhesión o la apoptosis. La activación constitutiva de los RTKs tiene consecuencias negativas en el organismo y la sobreexpresión del EGFR se puede encontrar frecuentemente en el cáncer de colon, de mama, de vejiga, el cervical, el ovárico, de los riñones, el pancreático y en el de pulmón. La mutación que aumenta la actividad del EGFR en ausencia de la unión del ligando es a veces la principal causa de cambios tumorigénicos. Por lo tanto, la regulación a la baja del EFGR es un paso crítico en la modulación de la actividad del receptor y tiene lugar por endocitosis, ubiquitinización del receptor y por la subsiguiente degradación lisosomal. En este proceso, las proteínas c-Cbl y Cbl-b desempeñan un rol crucial actuando como ligasas de ubiquitina y como adaptadores endocíticos. La formación de grandes complejos proteicos capaces de eliminar receptores activados de la membrana plasmática a través de la vía dependiente o independiente de clatrina es clave en esta endocitosis. Rol de las proteínas adaptadoras en la regulación de EGFR Las moléculas adaptadoras son proteínas con uno o varios dominios capaces de interactuar con ligandos celulares y en general no tienen actividad enzimática. Tienen la capacidad de unir proteínas para formar grandes complejos multiméricos que contribuyen a la especificidad y la eficiencia de las respuestas celulares. Los mismos adaptadores pueden actuar a diferentes niveles en diferentes cascadas de señalización. En cuanto a la estimulación celular, la proteína Cbl es translocada hacia los RTKs activados y actúa como una proteína adaptadora multifuncional capaz de reclutar otras proteínas reguladoras de la endocitosis. Una vez que EGFR es estimulado como consecuencia de la unión del ligando, el receptor se fosforila y Cbl puede, entonces, unirse a los motivos específicos de fosfotirosina por medio de sus dominios SH2. Como resultado de esta unión, Cbl monoubiquitiniza en distintas regiones a EGFR y orienta al receptor, que contiene la vesícula, hacia la ruta de degradación y que conlleva la terminación de la señal del RTK. La proteína adaptadora CIN85 El reclutamiento del adaptador CIN85 por Cbl es crucial para la iniciación de los primeros pasos del proceso de regulación a la baja de EGFR. Se ha observado que la inhibición de la interacción Cbl-CIN85-endofilina es suficiente para bloquear la endocitosis de EGFR sin afectar la capacidad de Cbl de ubiquitinizar los receptores activados. CIN85 se expresa de manera ubicua. En cuanto a la estructura de CIN85, CIN85 presenta tres dominios SH3 en el extremo N-terminal, seguidos de una región rica en prolina y un dominio en forma de hélice superenrollada en su extremo C-terminal. Los dominios SH3 comparten una alta similitud ente ellos y se ha sugerido que pueden tener especificidades de unión coincidentes. La formación del complejo entre CIN85 y Cbl ocurre a través de la unión selectiva de los dominios SH3 de CIN85 a un motivo atípico de prolina-arginina presente en la región C-terminal de c-Cbl y Cbl-b. La estructura del dominio SH3 del extremo N-terminal de CIN85 unido a un péptido procedente de Cbl se obtuvo en el laboratorio en el que realizaré mi TFG. A parte de esta importante interacción, los dominios SH3 de CIN85 pueden reconocer motivos atípicos en otras proteínas como CD2, BLNK, AIP1, SB1 etc. que pueden modular la respuesta del EGFR y participar en otros procesos biológicos. El objetivo de este proyecto es investigar la interacción de los dominios de CIN85 con otras proteínas celulares.

[EN] Relevance of EGFR The Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is a Receptor Tyrosine Kinase (RTK). Upon interaction with its natural ligand (the Epidermal Growth Factor, EGF) is responsible for a wide variety of important biological processes, such as cell proliferation, differentiation, survival, migration, adhesion or apoptosis. Constitutive activation of RTKs has negative consequences in the organism and overexpression of EGFR is frequently found in colon, breast, bladder, cervical, ovarian, kidney, pancreatic and non-small cell lung cancer. Mutation that activate the kinase activity of EGFR in the absence of ligand binding are often the main cause of tumorigenic changes. Therefore, down-regulation of EGFR is a critical step in modulating receptor activity and takes place by endocytosis, receptor ubiquitination, and subsequent lysosomal degradation. In this process, c-Cbl, and Cbl-b proteins play a crucial role by acting as ubiquitin ligases as well as endocytic adaptor molecules. Key to this endocytosis is the formation of large protein complexes capable of removing activated receptors from the plasma membrane via clathrin-dependent or independent pathways. Role of the adaptor proteins in regulation of EGFR Adaptor molecules are proteins with one or several domains capable of interacting with cellular ligands and in general do not have an enzymatic activity. They have the ability to connect proteins forming large multimeric complexes that contribute to the specificity and efficiency of cellular responses. The same adaptors can act at different levels in different signaling cascades. Upon cell stimulation, Cbl proteins are translocated to activated RTKs and act as multifunctional adaptor proteins, capable of recruiting additional endocytic regulatory proteins. Once EGFR is stimulated upon ligand binding the receptor is phosphorylated and Cbl can then bind to specific phosphotyrosine motifs through its SH2 domain. As a result Cbl multiple monoubiquitination of EFGR takes place and sorts the receptor-containing vesicle to a degradation route that leads to the termination of the RTK signal. The adaptor protein CIN85 The recruitment of the adaptor CIN85 by Cbl is crucial for the initiation of the early steps of multistep process of EGFR downregulation. It has been shown that inhibition of the Cbl-CIN85-endophilin interaction is sufficient to block EGFR endocytosis without affecting the ability of Cbl to ubiquitinate activated receptors. CIN85 is ubiquitously expressed. The domain structure of CIN85 shows three SH3 domains at the N-terminus, followed by proline-rich region and a C-terminal colied-coil domain. The SH3 domains share a very high similarity among themselves and it has been suggested that they might have overlapping specificities in binding. Complex formation between CIN85 and Cbl occurs via the selective binding of SH3 domains of CIN85 to an atypical proline-arginine motif present in the C-terminal region of c-Cbl and Cbl-b. The structure of the N-terminal CIN85 SH3 domain with a peptide from Cbl was obtained in the host laboratory. Appart from this important interaction, the CIN85 SH3 domains can recognize atypical motifs in other proteins such as CD2, BLNK, AIP1, SB1, etc. that can modulate the EFGR response and participate in other biological processes. The purpose of this research project is to investigate the interaction of CIN85 domains with other cellular partners.