Producción in vitro de la proteína Klotho para el análisis de muestras humanas de cerebros de Alzheimer

Abstract

[ES] La proteína klotho es una β-glucuronidasa cuya sobrexpresión está relacionada con la prolongación de la vida. A pesar de que su mecanismo de acción todavía no se conoce con exactitud, estudios recientes sugieren que klotho podría evitar el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA) asociado con el envejecimiento, probablemente inhibiendo la señalización insulina/IGF-1, y por lo tanto el daño oxidativo en el cerebro. El objetivo de este estudio es investigar la expresión de la proteína klotho en muestras humanas de cerebros con EA. Para lograrlo, se requiere la producción previa de la proteína klotho in vitro. Con este fin, el gen klotho será clonado en un vector de expresión (pGV). Después, se llevará a cabo la transfección transitoria en la línea celular humana HEK 293 para la producción in vitro de la proteína. El extracto de proteína total será cuantificado. La proteína klotho será analizada por Western Blot y cuantificada por desitometría. Con los datos obtenido se realizará una curva patrón para el posterior análisis y cuantificación relativa de la proteína klotho en las muestras humanas de cerebros.

[EN] Klotho protein is a β-glucuronidase whose overexpression is related to life extension. Despite its mechanism of action is not fully understood, recent studies suggest that klotho might prevent the development of Alzheimer's disease (AD) associated with aging, probably by inhibiting insulin/IGF-1 signaling, hence oxidative injury in the brain. The aim of this study is to investigate the expression of klotho protein in human samples of AD. To achieve this, in vitro production of human recombinant klotho is previously required. For this purpose, klotho gene will be cloned in an expression vector (pGV). After that, transient transfection in the human cell line HEK 293 will be performed for in vitro klotho production. The total protein extract will be then quantified. Klotho protein will be analysed by Western Blot and quantified by densitometry. With these data, a calibration curve will be obtained for subsequent analysis and relative quantification of human brain samples.

[CA] La proteïna Klotho és un factor neuroprotector rel·lacionat amb l’envelliment i la malaltia d’Alzheimer (AD, de l’anglés Alzheimer’s disease). La variant secretada de la proteïna (s-KL), la més expressada en humans, sembla tindre un paper important en el manteniment de les funcions cognitives. És per això que l’estudi de la variant s-KL en humans és de gran rellevància per poder entendre la seua implicació en l’AD i l’envelliment. En aquest treball, el cDNA de la proteïna s-KL humana va ser clonat en un vector d’expressió eucariota. Després, la proteïna s-KL fou produïda per transfecció transitòria en la línia cel·lular humana HEK-293, i els seus extractes proteics foren quantificats i analitzats per Western Blot. La immunodetecció de s-KL es va realitzar mitjançant un anticòs específic (K-18.2) mai abans utilitzat, i per al qual es va desenvolupar un nou protocol. Aquest assaig va permetre avaluar la producció de s-KL per les cèl·lules transfectades i la especificitat del nou anticòs K-18.2. Finalment, es va portar a terme una validació complementaria de l’anticòs K-18.2 utilitzant extractes proteics de cervells humans, obtinguts de pacients sans i malalts d’AD.