Los genes NGATHA: análisis genético y molecular de su papel en la morfogénesis del gineceo de Arabidopsis thaliana

Abstract

[EN] The four highly related family genes NGATHA (NGA), which encode transcription factors with a B3 DNA-binding domain, are functionally redundant in the development of the style and stigma in a dose-dependent manner. While the single mutants in the NGA genes only show very subtle or no defects in carpel morphology, the multiple mutants exhibit greater defects in the development of the apical part of the gynoecium, which is completely altered in the quadruple mutant. This phenotype is related with the lack of activation, in the apical part of the gynoecium, of the YUCCA genes, which encode enzymes involved in auxin synthesis. The phenotype of the nga mutants is very similar to the mutants in the SHORT INTERNODES/STYLISH (SHI/STY) genes, and it has been shown that NGA and STY work together to promote style specification, directing the YUC-mediated auxin synthesis in the apical part of the gynoecium (Trigueros et al., 2009). In addition, the phenotypes of the nga mutants and of the plants over-expressing NGA, resemble those observed in genotypes with altered expression of genes with relevant functions in gynoecium morphogenesis. Thus, it can be inferred that the NGA genes have a key role in gynoecium morphogenesis, though their genetic interaction with the network of genes controlling this process is still unclear; therefore, in this thesis we have carried out a detailed genetic analysis to determine the position and role of NGA genes in this network. With this aim, our first approach has been to identify and characterize regulators of the expression of NGA genes. As the four NGA genes show almost identical expression patterns, it seemed likely that they shared common regulators. For that reason, we made a bioinformatic analysis of the promoter regions of the NGA genes looking for conserved regions. In this analysis we identified two conserved regions and we have used these conserved domains to carry out yeast one-hybrid screenings of Arabidopsis cDNA libraries. These screenings led to the identification of a transcription factor from the SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) family and three from the TEOSINTE BRANCHED1, CYCLOIDEA, AND PROLIFERATING CELL FACTORS (TCP) family as candidates to regulate NGA expression. After the identification of these candidates, different molecular analysis have been carried out to confirm the binding of these transcription factors to the promoters of the NGA genes. To validate their genetic interaction we have also characterized mutants and over-expression lines of these candidates, as well as genetic combinations of these mutants with reporter and loss- and gain-of-function lines of the NGA genes. In addition, in this thesis we were interested in analyzing in detail the genetic interactions of NGA genes with other genes with a key role in the development of the gynoecium apical tissues. We had observed that over-expression lines of HEC1, HEC3 and NGA3, showed similar phenotypes in the fruit: reduced ovaries and enlarged apical regions and gynophores, similar phenotypes to those of mutants affected in auxin signaling. For that reason, a great part of our analysis has been focused to elucidate the regulatory hierarchy between both factors NGA and HEC. To study this we have carried out genetic analysis combining reporter lines of these genes with mutants in NGA or HEC or with their over-expression lines. We have also carried out several molecular assays which had allowed us to conclude that both factors act at the same level, forming part of a transcriptional complex with cooperative activity. Finally, though similar genetic and molecular analysis in which other genes of the bHLH transcription factor family have been included, we have inferred the participation of the NGA proteins in a high-order complex, possibly composed by NGA, HEC and the IND and SPT proteins, which would be required for correct auxin signaling during gynoecium morphogenesis and stigma development in Arabidopsis thaliana.

[ES] La familia de los genes NGATHA (NGA) está formada por cuatro genes que codifican factores de transcripción de tipo B3 (Álvarez et al., 2006). Los genes NGA son funcionalmente redundantes en el desarrollo del estilo y el estigma de una manera dosis-dependiente, mientras que los mutantes individuales no presentan defectos en la morfología del carpelo, los mutantes múltiples presentan defectos cada vez mayores en el desarrollo de la parte apical del gineceo que está completamente alterada en el cuádruple mutante. Este fenotipo mutante está relacionado con la falta de activación en el dominio apical del gineceo de los genes YUCCA (YUC), que codifican enzimas de la ruta de biosíntesis de auxinas. Los fenotipos mutantes de NGA son muy similares a los causados por las mutaciones en la familia SHORT INTERNODES/STYLISH (SHI/STY) y se ha mostrado que NGA y STY promueven la especificación del estilo, dirigiendo la síntesis de auxinas mediada por YUC en el dominio apical del gineceo (Trigueros et al, 2009). Por otro lado, los fenotipos de los mutantes y de las líneas de sobreexpresión de NGA recuerdan a los fenotipos observados en fondos donde la expresión de otros genes con funciones relevantes en la morfogénesis del gineceo está alterada. Así, es posible inferir que los genes NGA tienen un papel clave en este proceso, aunque su relación genética con otros factores importantes en el mismo no está clara, por lo que en la presente tesis hemos pretendido realizar un análisis genético detallado para determinar su posición y papel en estas rutas. La primera aproximación que hemos abordado ha sido determinar posibles reguladores de estos genes. Como los genes NGA muestran patrones de expresión similares parecía probable que tuvieran reguladores comunes, por lo que mediante un análisis informático de los promotores de los genes NGA identificamos dos regiones conservadas en todos los promotores y hemos utilizado estos dominios conservados para llevar a cabo ensayos de híbrido simple en levadura identificando como posibles reguladores a un factor de la familia de los SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL), y a tres miembros de la familia TEOSINTE BRANCHED1, CYCLOIDEA, AND PROLIFERATING CELL FACTORS (TCP). Tras la identificación de los reguladores candidatos, se han llevado a cabo análisis moleculares para confirmar la unión de estos a los promotores de los genes NGA. Y hemos caracterizado los mutantes y las líneas de sobreexpresión de estos posibles reguladores, así como las combinaciones genéticas de los mutantes correspondientes con las líneas reportadoras de NGA y con mutantes de pérdida y ganancia de función NGA para validar su interacción genética. Además en esta tesis doctoral nos interesaba profundizar en el análisis de las interacciones genéticas de NGA y otros factores clave en la morfogénesis de los tejidos apicales del gineceo. Habíamos observado que las líneas de sobreexpresión de HECATE1 (HEC1), HEC3 y NGA3 presentaban fenotipos similares en el fruto: ovarios reducidos, regiones apicales aumentadas y ginóforos largos, fenotipos similares a los de mutantes afectados en la señalización de auxinas. Para investigar la posible relación funcional entre NGA y HEC hemos llevado a cabo análisis genéticos combinando las líneas reportadoras de estos genes con los mutantes nga o hec, o con las líneas de sobreexpresión; y hemos realizado diferentes ensayos moleculares, mediante los cuales hemos comprobado que ambos factores actúan al mismo nivel formando parte de un complejo transcripcional con actividad cooperativa. Finalmente, mediante análisis genéticos y moleculares similares en los que hemos incluido otros genes de la familia bHLH, hemos deducido la necesaria participación de las proteínas NGA en un complejo de mayor orden formado por NGA, HEC y también los factores IND y SPT, que sería necesario para la correcta señalización de auxinas durante la morfogénesis del gine

[CA] Els quatre gens NGATHA (NGA), que codifiquen factors de transcripció de tipus B3 (Álvarez et al., 2006), són funcionalment redundants en el desenvolupament de l'estil i l'estigma d'una manera dosi-depenent, mentre que els mutants individuals no presenten defectes en la morfologia del carpel, els mutants múltiples presenten defectes cada vegada majors en el desenvolupament de la part apical del gineceu que està completament alterada en el quàdruple mutant. Aquest fenotip mutant està relacionat amb la falta d'activació en el domini apical del gineceu dels gens YUCCA (YUC), que codifiquen enzims de la ruta de biosíntesi de auxines. Els fenotips mutants de NGA són molt similars als causats per les mutacions en la família SHORT INTERNODES / STYLISH (SHI / STY) i s'ha mostrat que NGA i STY promouen l'especificació de l'estil, dirigint la síntesi d'auxines mediada per YUC al domini apical del gineceu (Trigueros et al, 2009). D'altra banda, els fenotips dels mutants i les línies de sobreexpressió de NGA recorden als fenotips observats en fons on l'expressió d'altres gens amb funcions rellevants en la morfogènesi del gineceu està alterada. Així, és possible inferir que els gens NGA tenen un paper clau en aquest procés, encara que la seua relació genètica amb altres factors importants en el mateix no està clara, pel que en la present tesi hem volgut realitzar una anàlisi genètica detallat per determinar la seva posició i paper en aquestes rutes. La primera aproximació que hem abordat ha sigut determinar possibles reguladors d'aquests gens. Com els gens NGA mostren patrons d'expressió similars semblava probable que tinguessin reguladors comuns, pel que mitjançant una anàlisi informàtic dels promotors dels gens NGA identificarem dos regions conservades en tots els promotors i hem utilitzat aquests dominis conservats per dur a terme escrutinis de híbrid simple en llevat identificant com a possibles reguladors a un factor de la família dels SQUAMOSA PROMOTOR BINDING PROTEIN-LIKE (SPL), i a tres membres de la família TEOSINTE BRANCHED1, CYCLOIDEA, AND PROLIFERATING CELL FACTORS (TCP). Després de la identificació dels reguladors candidats, s'han dut a terme anàlisis moleculars per confirmar la unió d'aquests als promotors dels gens NGA. I hem caracteritzat mutants i les línies de sobreexpressió d'aquests possibles reguladors, així com les combinacions genètiques dels mutants corresponents amb les línies reportadores de NGA i amb mutants de pèrdua i ganància de funció NGA per validar la seua interacció genètica. A més en aquesta tesi doctoral ens interessava aprofundir en l'anàlisi de les interaccions genètiques de NGA i altres factors clau en la morfogènesi dels teixits apicals del gineceu. Havíem observat que les línies de sobreexpressió de HECATE1 (HEC1), HEC3 i NGA3 presentaven fenotips similars en el fruit i que aquestos fenotips eren semblants als de mutants afectats en la senyalització de auxines. Per investigar la possible relació funcional entre NGA i HEC hem dut a terme anàlisis genètiques combinant les línies reportadoras d'aquests gens amb els mutants nga o hec, o amb les línies de sobreexpressió; i hem realitzat diferents assajos moleculars, mitjançant els quals hem comprovat que tots dos factors actuen al mateix nivell formant part d'un complex transcripcional amb activitat cooperativa. Finalment, mitjançant anàlisis genètiques i moleculars similars en què hem inclòs altres gens de la família bHLH, hem deduït la necessària participació de les proteïnes NGA en un complex de major ordre format per NGA, HEC i els factors IND i SPT, que seria necessari per a la correcta senyalització de auxines durant la morfogènesi del gineceu i la formació de l'estigma en Arabidopsis thaliana.