Inmunodetección de la proteina nanog en embriones preimplantacionales producidos in vitro por fiv y partenogénesis en pequeños rumiantes

Abstract

[EN] Since the development of techniques for in vitro embryo production there is an important demand of methods to assess the quality of the generated embryos. One of the main criteria to assess the quality of produced blastocysts is the ratio between the number of inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE). Nanog and Cdx2 proteins are founded in the ICM cells and TE cells respectively in mouse embryos. The aim of this work was tune up, in our laboratory, the immunodetection analysis of Nanog protein in goat and sheep embryos produced by in vitro fertilization (IVF) and parthenogenesis. We have produced 640 ovine embryos by IVF and 1083 by parthenogenetic activation (PA). In caprine we produced 205 embryos by IVF and 66 by PA. All produced embryos are grouped in three different groups: 2 to 8 cells embryos, morulae, and blastocysts. We used the routine techniques of laboratory to carry out IVF and PA. For the Nanog protein analysis we used 286 embryos and different protocols were performed to optimize the suitable one for sheep and goats. By using the original immunodetection protocol (mouse), it was observed that Nanog protein needed an optimization by changing the primary antibody from the original (polyclonal rabbit anti-­‐Nanog) to the human one (rabbit anti-­‐Human Nanog). We found expression of Nanog protein in each cell in: 2-­‐8 cells embryos, morulae and blastocysts. It was contrary to our expectations considering that the mouse Nanog protein is localized, in blastocysts, only in the ICM cells and it is not found in the previous embryonic stages. Our produced blastocysts shows Nanog signal in 66’7% and 89’6% en sheep, and 83’6% and 60’5% in goat of total cells, which indicates that this signal was also localized in the TE cells and not only on the ICM, as it was expected. The Cdx2 was located in 68’97% of cells in the blastocyst stage, indicating that the labeling was correct only in the TE. In conclusion, our data do not show significant differences between sheep and goat embryos produced by IVF and PA.

[ES] Desde que se desarrollaron las técnicas de producción de embriones in vitro existe una demanda de métodos que permiten evaluar la calidad de los embriones generados. Uno de los criterios de la calidad de los blastocistos producidos es la relación entre el número de células del Masa Celular Interna (MCI) y del Trofoectodermo (TE). La proteína Nanog y la Cdx2, son proteínas que se encuentras en la MCI y TE, respectivamente en embriones de ratón. El objetivo de este trabajo fue poner a punto en nuestro laboratorio en embriones caprinos y ovinos producidos por fecundación in vitro (FIV) y partenogénesis, el análisis de inmunodetección de la proteína Nanog. Producimos 640 embriones ovinos mediante FIV y 1083 embriones por activación partenogenética (AP). En caprino producimos 205 embriones por FIV y 66 por AP. Los embriones producidos son agrupados en tres grupos: embriones de 2 a 8 células, mórulas y blastocistos. Las técnicas utilizadas para la FIV y AP son las rutinarias del laboratorio. Para el análisis de la proteína Nanog utilizamos 286 embriones con diferentes protocolos hasta optimizar el adecuado para ovino y caprino. Utilizando el protocolo de inmunodetección original (de ratón), se observó que la proteína Nanog necesitó una optimización para los embriones de oveja y cabra, cambiando el anticuerpo primario original rabbit polyclonal anti-­‐Nanog por rabbit anti-­‐Human Nanog. Encontramos expresión de la proteína Nanog en cada célula de embriones de 2-­‐8 células, mórulas y blastocistos, contrariamente a lo esperado ya que la proteína Nanog de ratón solo se localiza en las células MCI y no en los anteriores estadios embrionarios. En nuestros blastocistos producidos se observa que el número de células con señal Nanog es del 66’7% y 89’6% en ovino, y 83’6% y 60’5% en caprino del total de células, lo que indica que esta señal estuvo localizada también en las células del TE y no solo en las del MCI, como era lo esperado. El Cdx2 se localizó en el 68’97% de las células del blastocisto, indicando que era correcto su marcaje solo en las TE. En conclusión nuestros datos no muestras diferencias significativas entre los embriones de ovino y caprino producidos mediante FIV y AP