Obtención de cíbridos de cítricos mediante fusión de protoplastos y caracterización molecular del genoma nuclear y citoplasmático

Abstract

[EN] Due to their economic importance, citrus crops require genetic improvement programmes. Traditional improvement techniques involve a number of limitations, such as sexual incompatibility, apomixis and masculine and femenine sterility. Such limitations of traditional improvement programmes can be approached and overcome through somatic hybridization, a biotechnological tool based on the isolation and subsequent fusion of two non-sexual (somatic) cells without cell walls (protoplasts). By means of this technique it is possible to regenerate cybrids, that is, plants that combine the nuclear genome from one parental and the mitochondrial and/or chloroplastic genome from the other parental. Our objective in this piece of research is twofold: (1) to obtain cytoplasmatic somatic hybrids (cybrids) by means of electric fusion of protoplast; and (2) to analyse ploidy using flow cytrometry and to characterize the nuclear and cytoplasmatic genome using SSR microsatellite markers and Indel. The results of this characterization show that somatic hybrids are not always the exact sum of the two parentals. Sometimes, loss or substitution of alleles from parentals can take place. This research has also allowed us to detect the presence of recombination events between the mitochondrial genomes of the parentals. In vitro micrografting of shoots, roots and embryos was used to regenerate the plants obtained by means of somatic hybridization. In vitro micrografting proved to be highly efficient.

[ES] Dada su importancia económica, los cítricos requieren de programas de mejora genética. La mejora clásica implica una serie de limitaciones, tales como la incompatibilidad sexual, la apomixis, y la esterilidad femenina y masculina. Dichas limitaciones de la mejora genética clásica pueden abordarse y superarse mediante la hibridación somática, una técnica biotecnológica basada en el aislamiento y posterior fusión de dos células no sexuales (somáticas), privadas de pared celular (protoplastos). Mediante esta técnica es posible regenerar cíbridos, es decir, plantas que combinan el genoma nuclear de un parental con el genoma mitocondrial y/o cloroplástico del otro. Son dos los objetivos de este trabajo: 1) la obtención de híbridos somáticos citoplasmáticos (cíbridos) mediante fusión eléctrica de protoplastos; y 2) el análisis de la ploidía mediante citrometría de flujo y la caracterización del genoma nuclear y citoplasmático mediante la utilización de marcadores microsatelites SSR e Indel. Los resultados de esta caracterización demuestran que los híbridos somáticos no siempre son la suma exacta de los dos parentales. En ocasiones, puede producirse la pérdida o sustitución de alelos pertenecientes a los parentales. Esta investigación también ha permitido observar la presencia de eventos de recombinación entre los genomas mitocondriales de los parentales. Para regenerar las plantas obtenidas mediante la hibridación somática, se utilizó la técnica de microinjerto in vitro de brotes, raíces y embriones, que demostró una elevada eficiencia.

[CA] Donada la seua importància econòmica, els cítrics requereixen de programes de millora genètica. La millora genètica clàssica implica un seguit de limitacions, com ara la incompatibilitat sexual, l’apomixi, i l’esterilitat femenina i masculina. Aquestes limitacions de la millora genètica clàssica poden abordar-se i superar-se mitjançant la hibridació somàtica, una tècnica biotecnològica basada en l’aïllament i posterior fusió de dues cèl·lules no sexuals (somàtiques), privades de paret cel·lular (protoplasts). Mitjançant aquesta tècnica és possible regenerar cíbrids, és a dir, plantes que combinen el genoma nuclear d’un parental amb el genoma mitocondrial i/o cloroplàstic de l’altre parental. Són dos els objectius d’aquest treball: 1) l’obtenció d’híbrids somàtics citoplasmàtics (cíbrids) mitjançant fusió elèctrica de protoplasts; i 2) l’anàlisi de la ploidia mitjançant citometria de flux i la caracterització del genoma nuclear i citoplasmàtic mitjançant la utilització de marcadors microsatèl·lits SSR i Indel. Els resultats d’aquesta caracterització demostren que els híbrids somàtics no sempre són la suma exacta dels dos parentals. En ocasions, pot produir-se la pèrdua o substitució d’al·lels pertanyents als parentals. Aquesta investigació també ha permès d’observar la presència d’esdeveniments de recombinació entre els genomes mitocondrials dels parentals. Per regenerar les plantes obtingudes mitjançant la hibridació somàtica, es va utilitzar la tècnica de microempelt in vitro de brots, arrels i embrions, la qual va demostrar una elevada eficiència.