Generación de líneas T-DNA de tomate (Solanum lycopersicum) para la identificación de mutantes de inserción alterados en la morfogénesis y el desarrollo vegetal

Abstract

Knowledge of the key genes that affect the development of plants and their interaction with external agents is a very important aspect, both from a basic point of view and applied. Screening of mutagenized populations allows the identification of plants mutants and, from them, genes responsible for a particular character. Compared with other methodological alternatives (chemical or physical mutagens), insertional mutagenesis with T-DNA provides an additional advantage, the gene is tagged by an insert. Its identification is easier because it is possible to clone the mutated gene from the known T-DNA sequence. In order to identify genes that control early developmental traits, the screening of the progenies of 762 tomato T-DNA lines was carried out by using plant tissue culture techniques. The use of this methodology presents some advantages respect to in vivo scrutiny: less need of time and space, greater homogeneity in the environmental conditions, facility to detect alterations in the root system and possibility of detecting affected mutants in their morphogenetic capacity. We have identified 23 different mutant phenotypes that have been distributed by their most significant phenotype in altered mutants in root development, shoot development, cell death and morphogenetic response. The phenotypic and genetic characterization of all the mutants was made and it was possible to determine if there was cosegregation between the mutant phenotype and a T-DNA insert in five of the mutant lines identified. Finally, it has been possible to identify the genes responsible for the phenotype in two of the detected mutants.

El conocimiento de los genes clave que afectan al desarrollo de las plantas y su interacción con agentes externos es un aspecto muy importante, tanto desde un punto de vista básico como aplicado. El escrutinio de poblaciones de plantas mutagenizadas permite la identificación de mutantes y, a partir de ellos, los genes responsables de un carácter concreto. Comparada con otras alternativas metodológicas (mutágenos químicos o físicos) la mutagénesis insercional con T-DNA aporta una ventaja adicional, ya que si el gen queda etiquetado por un inserto su identificación es más sencilla ya que se puede conocer de qué gen se trata a partir de la secuencia conocida del T-DNA. Con el fin de identificar genes que controlan caracteres del desarrollo temprano se ha llevado a cabo el escrutinio de las progenies de 762 líneas T-DNA de tomate mediante la utilización del cultivo in vitro. El empleo de esta metodología presenta ciertas ventajas respecto al escrutinio in vivo: menor necesidad de tiempo y espacio, mayor homogeneidad en las condiciones ambientales, facilidad para detectar alteraciones en el sistema radicular y posibilidad de detectar mutantes afectados en su capacidad morfogenética. Se han identificado 23 fenotipos mutantes diferentes que se han distribuido por su fenotipo más significativo en mutantes alterados en el desarrollo radicular, desarrollo de parte aérea, muerte celular y respuesta morfogenética. Se realizó la caracterización fenotípica y genética de todos los mutantes y se lo logró determinar si existía cosegregación entre el fenotipo mutante y un inserto T-DNA en cinco de las líneas mutantes identificadas. Por último se ha logrado identificar los genes responsables del fenotipo aado en dos de los mutantes detectados.

El coneixement dels gens clau que afecten el desenrotllament de les plantes i la seua interacció amb agents externs és un aspecte molt important, tant des d'un punt de vista bàsic com aplicat. L'escrutini de poblacions de plantes mutagenitzades permet la identificació de mutants i, a partir d'ells, els gens responsables d'un caràcter concret. Comparada amb altres alternatives metodològiques (mutágenos químics o físics) la mutagènesi insercional amb T-DNA aporta un avantatge adicional, ja que si el gen queda etiquetat per un inserit la seua identificació és més senzilla ja que es pot conéixer de quin gen es tracta a partir de la seqüència coneguda del T-DNA. A fi d'identificar gens que controlen caràcters del desenrotllament primerenc s'ha dut a terme l'escrutini de les progènies de 762 línies T-DNA de tomaca per mitjà de la utilització del cultiu in vitro. L'us d'esta metodologia presenta certs avantatges respecte a l'escrutini in vivo: menor necessitat de temps i espai, major homogeneïtat en les condicions ambientals, facilitat per a detectar alteracions en el sistema radicular i possibilitat de detectar mutants afectats en la seua capacitat morfogenética. S'han identificat 23 fenotips mutants diferents que s'han distribuït pel seu fenotip més significatiu en mutants alterats en el desenrotllament radicular, desenrotllament de part aèria, mort cel¿lular i resposta morfogenética. Es va realitzar la caracterització fenotípica i genètica de tots els mutants i se va determinar que existia cosegregación entre el fenotip mutant i un inserit T-DNA en cinc de les línies mutants identificades. Finalment s'ha aconseguit identificar els gens responsables del fenotip en dos dels mutants detectats.