Disección de la estructura secundaria in silico, in vitro e in vivo de RNAs viroidales nucleares y cloroplásticos

Abstract

Viroids, small circular RNAs (246-401 nt) with a high content in secondary structure that until recently have been detected only in higher plants, are the simplest infectious agents in the biological scale and do not encode any protein. Therefore, they depend on their genomic sequence and structural motifs to use the transcription, processing, and trafficking machinery of their hosts in order to be replicated and invade them systemically, leading eventually to economically important diseases. The secondary structure of nuclear viroids (family Pospiviroidae) is generally rod-like, while in some chloroplastic viroids (family Avsunviroidae) it is multi-branched. These conformations are mostly supported by data in silico (resulting from algorithms that predict the secondary structure with minimal free energy) and in vitro (using biophysical or biochemical approaches). The assumption that the conformation of the viroid RNAs in vitro is similar or even identical to that adopted in vivo is questionable due, among other reasons, to the different ionic conditions used in in vitro analyses with respect to those existing in planta, as well as to a number of interactions with the proteins or other factors in the host. Therefore, in the present Doctoral Thesis, the in vivo structures of three viroids have been studied, applying different approaches. In the eggplant latent viroid (ELVd), taking advantage of its high genetic variability, co-variations and compensatory mutations have been screened in natural variants in order to confirm or refine in vivo the structures predicted in silico for both viroid strands and those obtained through in vitro SHAPE (2'-hydroxyl groups analysed by primer extension). The results of the three methodologies are consistent for ELVd (+) RNA and lead to a quasi-rod-like conformation with a bifurcation at each terminal domain. This structure, although similar, is not identical to that of ELVd (-) RNA, because its conformation has a central cruciform motif (confirmed in vivo by the presence of covariations therein) and because, in addition, both RNAs show different electrophoretic mobilities in native polyacrylamide gels. The in vitro results for ELVd (-) RNA were less consistent with those obtained in silico and in vivo. On the other hand, the high accumulation of the monomeric circular (mc) positive RNAs of potato spindle tuber viroid (PSTVd) and avocado sunblotch viroid (ASBVd) in Nicotiana benthamiana, and avocado respectively, allowed the determination of the in vivo structure of both RNAs by SHAPE, enabling their direct comparison with the conformations derived previously in vitro using the same technique, and those predicted in silico. The structures determined in vivo for mc PSTVd (+) and mc ASBVd (+) RNAs are very similar (but not identical) to those observed in silico and by in vitro SHAPE. These results provide the first direct evidence that, in their physiological context, the circular RNAs of two viroids, one nuclear and other chloroplastic, are essentially naked and not strongly associated with host proteins. However, we have observed that the conserved central region of mc PSTVd (+) RNA, particularly the loop-E involved in replication and other functions, shows a lower SHAPE reactivity in vivo, possibly due to interactions with one or more proteins mediating these functions or to structural changes induced by other factors of their natural habitat. The low accumulation of mc ASBVd (-) RNA in its host, only allowed for the examination of its structure in silico and by in vitro SHAPE, leading to a rod-like conformation similar to, but not identical, that of mc ASBVd (+) RNA, since the electrophoretic mobility of both RNAs in native polyacrylamide gels is slightly different.

Los viroides, pequeños RNAs circulares (246-401 nt) con un elevado contenido en estructura secundaria que hasta ahora sólo han sido detectados en plantas superiores, son los agentes infecciosos más simples de la escala biológica y no codifican proteína alguna. Por lo tanto, dependen de motivos de secuencia y estructura de su genoma para utilizar la maquinaria de transcripción, procesamiento y tráfico de sus huéspedes con el fin de ser replicados e invadirlos sistémicamente, llegando a producir enfermedades de importancia económica. La estructura secundaria de los viroides nucleares (familia Pospiviroidae) es en general de tipo varilla, mientras que presenta múltiples ramificaciones en algunos viroides cloroplásticos (familia Avsunviroidae). Estas conformaciones están sostenidas por datos mayoritariamente obtenidos in silico (con algoritmos que predicen la estructura secundaria con menor energía libre) e in vitro (por métodos biofísicos o bioquímicos). La asunción de que la conformación de los RNAs viroidales in vitro es similar o incluso idéntica a la que adoptan in vivo es cuestionable debido a las diferentes condiciones iónicas utilizadas en los análisis in vitro con respecto a las existentes in planta, así como a las interacciones con proteínas u otros factores del huésped. Por ello, en la presente Tesis Doctoral se han estudiado las estructuras in vivo de tres viroides aplicando diferentes metodologías. En el viroide latente de la berenjena (ELVd), aprovechando su gran variabilidad genética, se han rastreado covariaciones y mutaciones compensatorias en variantes naturales que confirmen o afinen in vivo las estructuras de las dos cadenas del viroide predichas in silico y las obtenidas in vitro mediante SHAPE (2'-hidroxilo analizada por extensión del cebador). Los resultados de las tres metodologías son consistentes entre sí para el ELVd (+) RNA y conducen a una conformación en varilla con una bifurcación en cada extremo. Esta estructura es similar pero no idéntica a la del ELVd (-) RNA, ya que su conformación presenta un motivo cruciforme central (confirmado in vivo por la presencia de covariaciones en el mismo) y, además, ambos RNAs muestran movilidades electroforéticas distintas en geles de poliacrilamida nativos. Los resultados in vitro para el ELVd (-) RNA fueron menos consistentes con los obtenidos in silico e in vivo. Por otra parte, la alta acumulación de las formas monoméricas circulares (mc) positivas de los viroides del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd) y del manchado solar del aguacate (ASBVd) en Nicotiana benthamiana y aguacate, respectivamente, ha permitido aplicar una modificación de la metodología SHAPE para determinar la estructura in vivo de ambos RNAs, facilitando su comparación directa con las estructuras previamente derivadas in vitro mediante la misma técnica, y las predichas in silico. Las estructuras in planta de los mc PSTVd (+) y mc ASBVd (+) RNAs son muy similares (pero no idénticas) a las observadas in silico y mediante SHAPE in vitro. Estos resultados aportan las primeras pruebas directas de que los RNAs circulares de dos viroides, uno nuclear y el otro cloroplástico, se encuentran en su contexto fisiológico mayoritariamente desnudos y no fuertemente asociados a proteínas del huésped. Sin embargo, hemos observado que la región central conservada del mc PSTVd (+) RNA, particularmente el bucle E implicado en replicación y otras funciones, muestra una menor reactividad SHAPE in vivo posiblemente debida a la interacción con una o más proteínas que medien dichas funciones o a cambios estructurales motivados por otros factores del hábitat natural. Dada la baja concentración en su huésped del mc ASBVd (-) RNA, su estructura únicamente se ha estudiado in silico y por SHAPE in vitro, conduciendo a una conformación de tipo varilla parecida a, pero no la misma que la del mc ASBVd (+) RNA, ya que la movilidad electroforética de los dos RNAs e

Els viroides, menuts RNAs circulars (246-401 nt) amb un elevat contingut en estructura secundària que fins ara només han estat detectats en plantes superiors, són els agents infecciosos més simples de l'escala biològica, i no codifiquen proteïnes. Per tant, depenen de motius de seqüència i estructura del seu genoma per tal d'utilitzar (i fins i tot modular) la maquinària de transcripció, processament i tràfic dels seus hostes amb la finalitat de ser replicats i envair-los sistèmicament, arribant a produir malalties d'importància econòmica. L'estructura secundària dels viroides nuclears (família Pospiviroidae) és en general de tipus vareta, i presenta múltiples ramificacions en alguns viroides cloroplàstics (família Avsunviroidae). Aquestes conformacions estan majoritàriament sostingudes per dades in silico (mitjançant algoritmes que prediuen l'estructura secundària amb menor energia lliure) i in vitro (amb mètodes biofísics o bioquímics). L'assumpció que la conformació dels RNAs viroidals in vitro és similar, o fins i tot idèntica, a aquella que adopten in vivo és qüestionable a causa de, entre altres raons, les diferents condicions iòniques utilitzades en les anàlisis in vitro pel que fa a les existents in planta, així com a les interaccions amb proteïnes o altres factors de l'hoste. Per això, en la present Tesi Doctoral s'han estudiat les estructures in vivo de tres viroides aplicant diferents metodologies. En el viroide latent de l'albergínia (ELVd), aprofitant la seua gran variabilitat genètica, s'han rastrejat covariacions i mutacions compensatòries en variants naturals que confirmen o afinen in vivo les estructures de les dues cadenes del viroide predites in silico i aquelles obtingudes in vitro mitjançant SHAPE (2'-hidroxil analitzada per extensió del cebador). Els resultats de les tres metodologies són consistents entre si per a l'ELVd (+) RNA, i condueixen a una conformació en vareta amb una bifurcació a cada extrem. Aquesta estructura, si bé similar, no és idèntica a aquella de l'ELVd (-) RNA, ja que la seua conformació presenta un motiu cruciforme central (confirmat in vivo per la presència de covariacions en el mateix) i, a més, tots dos RNAs mostren mobilitats electroforètiques diferents en gels de poliacrilamida natius. Els resultats in vitro per a l'ELVd (-) RNA són menys consistents amb les dades obtingudes in silico i in vivo. D'altra banda, l'alta acumulació de les formes monomèriques circulars (mc) positives dels viroides del tubercle fusiforme de la creïlla (PSTVd) i del tacat solar de l'alvocat (ASBVd) en Nicotiana benthamiana i alvocat respectivament, ha permès aplicar una modificació de la metodologia SHAPE per a determinar l'estructura in vivo de tots dos RNAs, possibilitant la comparació directa amb l'estructura prèviament derivada in vitro amb la mateixa tècnica, i la conformació predita in silico. Les estructures de tipus vareta obtingudes per als mc PSTVd (+) i mc ASBVd (+) RNAs és molt similar (però no idèntica) a les observades in silico i mitjançant SHAPE in vitro. Aquests resultats aporten les primeres proves directes que, en el seu context fisiològic, els RNAs circulars dels viroides nuclears i cloroplàstics es troben majoritàriament nus i no fortament recoberts per proteïnes de l'hoste. No obstant això, hem observat una menor reactivitat SHAPE in vivo de la regió central conservada del PSTVd, particularment del bucle E implicat en replicació i en altres funcions, possiblement a causa de la interacció amb una o més proteïnes que intervenen aquestes funcions o a canvis estructurals motivats per altres factors de l'hàbitat natural. Atesa la baixa concentració del mc ASBVd (-) RNA en el seu hoste, la seua estructura únicament s'ha estudiat in silico i amb SHAPE in vitro, conduint a una conformació de tipus vareta semblant a, tot i que no la mateixa, aquella del mc ASBVd (+) RNA, ja que la mobilitat electroforètica de