Mecanismos de homeostasis del pH intracelular en levadura: activación de la bomba de protones Pma1 y estabilidad de RNA mensajeros de ciclinas G1

Abstract

[ES] El cáncer es una enfermedad poligénica, altamente heretogénea y de causas diversas. A partir del año 2000 se propusieron diferentes características distintivas (“cancer hallmarks”) que son comunes a los distintos tipos de cáncer. Entre ellas el valor de pH intra- y extracelular, más alcalino en el citosol y más ácido en el exterior que en células normales. El pH intracelular alto está relacionado con la regulación del crecimiento celular y la proliferación. Uno de los elementos involucrados en la regulación del pH intracelular es el sistema de expulsión de protones del citoplasma, que en caso de la levadura es la bomba de protones, o H + -ATPasa de la membrana plasmática Pma1, mientras que en células animales es NHE1, un antiportador de H + /Na+ menos potente que Pma1. Se ha demostrado que la expresión ectópica de Pma1 en fibroblastos de ratón aumenta el pH intracelular y causa transformación tumorogénica. TORC1, un complejo regulador del crecimiento en todos los eucariotas, está activado por pH intracelular alto, explicando el efecto de este parámetro sobre el crecimiento celular. En este trabajo se propone un modelo en Saccharomyces cerevisiae para estudiar el conjunto de funciones reguladoras de la homeostasis del pH, teniendo en cuenta los elementos descritos anteriormente. Para estudiar la relación entre el pH intracelular y el crecimiento se estudiaron los diferentes perfiles de crecimiento en la cepa silvestre y en mutantes con pérdida de función, en los cuales se compararon los valores obtenidos para la velocidad de crecimiento, el rendimiento y la duración de la fase Lag de las levaduras al suministrarles ácidos débiles. También se determinó el valor de pH intracelular de las cepas de interés y su variación al tratarlas con ácidos débiles como el acético. Por otro lado, para estudiar el papel de la fosfatasa Sit4 como posible regulador de la bomba de protones Pma1, se analizaron a través de la técnica Western Blot los niveles de fosforilación de los residuos Ser507 y Ser899 de Pma1 en la cepa silvestre y en la cepa mutante sit4Δ con presencia y ausencia de glucosa. Sit4 es regulada directamente por el complejo TOR y se estima que pueda tener un papel importante en la regulación de la homeostasis de pH intracelular. Por último se estudió el papel del gen SSD1 como estabilizador de los mensajeros de las ciclinas de la fase G1 del ciclo celular, como posible diana de la regulación de la proliferación.

[EN] Cancer is a polygenic and highly heterogeneous disease with diverse causes. Since 2000, different cancer hallmarks that are common to different types of cancer have been proposed. Among them is the intracellular and extracellular pH value, more alkaline in the cytosol and more acid in the exterior than normal cells. High values of intracellular pH are related to the regulation of cell growth and proliferation. One of the main elements involved in the pHi regulation is the proton expulsion system, which in the case of yeast is the proton pump, or H + - ATPase of the plasma membrane Pma1, whereas in animal cells it is NHE1, a H + /Na+ antiportrier less potent than Pma1. Ectopic expressión of Pma1 in mouse fibroblasts has been shown to increase intracellular pH and cause tumorogenic transofrmation. TORC1, a growth regulator complex in all eukaryotes is activated by high intracellular pH, explaining the effect of this parameter in cell growth. In this study, we propose a model in Saccharomyces cerevisiae, to study the set of regulatory functions of pH homeostasis, taking into account the elements described above. In order to study the relationship between intracellular pH and growth, different growth profiles were studied in the wild strain and mutants with loss of function, in which the values obtained for growth rate, yield and lag phase were compared between yeasts by supplying them with weak acids. The intracellular pH value of the strains of interest and their variation were also determined by treating them with weak acids, such as acetic acid. On the other hand, to study the role of the phosphatase Sit4 as a possible regulator of the proton pump, the phosphorylation levels of residues Ser507 and Ser899 of Pma1 were analyzed through Western Blot technique in the wild strains and sit4Δ with presence and absence. Sit4 is directly regulated by the TOR complex and is estimated to have an important role in the regulation of pHi homeostasis. Finally, the role of the SSD1 gene as a stabilizer of cyclin messengers of the G1 phase of the cells cycle was studied as a possible target for the regulation of proliferation.