Caracterización de un modelo knock-out en Drosophila melanogaster para el gen Gdap1 relacionado con la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth

Abstract

[ES] Charcot-Marie-Tooth (CMT) es una neuropatía periférica rara hereditaria para la que no hay un tratamiento específico, y se trata de una patología clínicamente y genéticamente muy heterogénea. Hasta la fecha, se conocen más de 60 genes cuyas mutaciones son causantes de CMT, uno de ellos es el gen GDAP1. Este gen codifica para una proteína de membrana mitocondrial externa que participa en la morfología y la distribución de las mitocondrias, la homeostasis del calcio y el estrés oxidativo; aunque no se conoce la función exacta de dicha proteína. Para contribuir en la elucidación de las bases moleculares de GDAP1, se han publicado dos modelos animales en Drosophila melanogaster, que a través de la sobreexpresión y el silenciamiento del ortólogo de GDAP1, recapitulan algunos de los fenotipos observados en pacientes (degeneración neuronal y muscular) además de cambios en el tamaño, morfología y distribución de las mitocondrias. Asimismo mediante metabolómica y análisis de la expresión génica se detectaron en estos modelos fallos en el metabolismo energético. Con todo lo anterior, se puso de manifiesto que D. melanogaster es un modelo útil para entender la patofisiología de las mutaciones de GDAP1 que dan lugar a CMT. Por este motivo, se decidió generar un modelo knock-out (KO) para Gdap1 en D. melanogaster mediante recombinación homóloga, y la subsecuente modificación del genoma. Este trabajo se centra en la validación y la caracterización del modelo KO para Gdap1 mediante diferentes aproximaciones: ensayos de viabilidad, ensayos biofísicos para el estudio de la capacidad locomotora, caracterización histológica de los tejidos de interés y análisis de expresión para los genes involucrados en las rutas metabólicas que se han visto alteradas en los anteriores modelos de Gdap1 en D. melanogaster. Con la caracterización del modelo se ha revelado que el KO generado tiene una mayor esperanza de vida respecto a la de las moscas control, modificaciones en la red mitocondrial de la retina y el músculo y alteraciones relevantes en la expresión de genes relacionados con la ruta de la insulina.

[EN] Charcot-Marie-Tooth (CMT) is an inherited rare peripheral neuropathy for which there is no specific treatment, and it is a clinically and genetically heterogeneous pathology. To date, more than 60 genes whose mutations cause CMT are known, GDAP1 being one of them. This gene encodes for a mitochondrial outer membrane protein that participates in mitochondrial morphology and distribution, calcium homeostasis and oxidative stress; but the specific function of this protein is unknown. In order to decipher the molecular basis of GDAP1, two Drosophila melanogaster models have been published, and they recapitulate some phenotypes observed in patients (neuronal and muscular degeneration) after Gdap1 over-expression or silencing; moreover these models have aberrant mitochondrial size, morphology and distribution. Using metabolomics and gene expression analysis, energy metabolism failures were detected in these models also. Then, it has been revealed that D. melanogaster is a useful model to study CMT associated with GDAP1 mutations. For this reason, a knock-out (KO) model of Gdap1 in D. melanogaster has been generated by homologous recombination and the subsequent genome modification. This work is focused on the validation and characterization of the Gdap1 KO model through different approaches: viability test, biophysical tests to study the locomotor capacity, histological characterization of tissues of interest and analysis of gene expression for genes involved in the metabolic pathways that were altered in the previous D. melanogaster Gdap1 models. The characterization of this KO model has shown an increase in lifespan compared to control flies, changes in the mitochondrial network of the retina and muscle and relevant alterations in the gene expression levels of genes involved in the insulin signaling.