Implementación y caracterización de nuevas versiones del sistema CRISPR para la Biología Sintética de Plantas

Abstract

[ES] El reciente desarrollo y expansión de la Biología Sintética ha abierto un horizonte de nuevas posibilidades tecnológicas mediante el diseño de organismos vivos con funciones biológicas mejoradas o con nuevas funciones hasta la fecha inexistentes. Todos estos avances han sido posible gracias al desarrollo de nuevas herramientas de editado genómico tales como las “Zinc-Fingers Nucleases” (ZFNs) o los “Transcription Activator-like Effectors Nucleases” (TALENs). Considerados ambos como hitos y herramientas fundamentales en la regulación genética tanto por su modularidad (capacidad de programación independiente para la actuación sobre cualquier gen deseado) como por su ortogonalidad (capacidad para no interferir en los circuitos genéticos y metabólicos naturales de la propia célula), características que constituyen los pilares fundamentales sobre los que se cimienta la Biología Sintética. Este tipo de herramientas facilitan la mejora de cultivos con respecto a los métodos tradicionales, puesto que permiten llevar a cabo una mutación dirigida. Estas, hacen posible el diseño y obtención de nuevas series alélicas que dan lugar a proteínas con nuevas características de interés o a la modulación de la afinidad de promotores específicos por su correspondiente DNA polimerasa. Del mismo modo, estas herramientas pueden adaptarse y servir para la regulación de la expresión génica. Permitiendo la construcción de nuevos circuitos genéticos mediante la activación o inhibición de distintos genes. Considerando ambos propósitos, tanto el editado genómico como el diseño de nuevos circuitos genéticos, el sistema CRISPR se postula como uno de los mayores avances tecnológicos dentro del campo de la Biología Sintética y se ha convertido rápidamente en una herramienta indispensable tanto dentro de este campo como en muchas otras áreas de la Biología Molecular. Entre sus ventajas destacan su programación fácil e intercambiable a través de la elección de la secuencia de RNA guía (gRNA); así como su ortogonalidad, cualidad otorgada por la especificidad de este gRNA de 20bp complementario a la secuencia diana. Por otro lado, en los últimos años se han desarrollado diversos sistemas de ensamblaje de ADN basados en el uso de piezas genéticas estandarizadas intercambiables con el fin de obtener complejas construcciones genéticas. Gracias a esto se están desarrollando grandes colecciones de estas piezas, con el objetivo de que puedan utilizarse en laboratorios de todo el mundo y puedan manipularse mediante los mismos protocolos. Por ello el diseño modular y estándar de nuevos dispositivos que sirvan de herramienta para la creación de nuevos circuitos genéticos o para la edición genética es clave para facilitar su acceso a todo el mundo. En este trabajo se ha llevado a cabo la caracterización de nuevas versiones del sistema CRISPR en plantas, ampliando así el rango de posibilidades que ofrece. Además, se ha adaptado su diseño al sistema de ensamblaje GoldenBraid3.0, uno de los estándares más utilizados en Biología Sintética de Plantas.

[EN] The recent development and expansion of synthetic biology has opened up a new horizon of technological possibilities by designing living organisms with improved biological functions or new ones inexistent up to date. All these breakthroughs have been possible thanks to the development of new genome editing tools such as Zinc-Fingers Nucleases (ZFNs) or Transcription Activator-like Effectors Nucleases (TALENs). Both considered as milestones and fundamental tools in gene regulation due to its modularity (ability of independent programming for action on any desired gene) and its orthogonality (ability to not interfere with the natural genetic and metabolic pathways of the cell itself) characteristics that constitute the mainstays of Synthetic Biology. This type of tools makes crop breeding easier by allowing to perform targeted mutagenesis. They grant directed design and development of new allelic series that result in proteins with new features of interest or that allows the modulation of promoters’ DNA polymerase affinity. Similarly, these tools can be adapted in order to upregulate or downregulate gene expression. They broaden the range of gene regulation possibilities and therefore they allow for the construction of new genetic circuits.

Considering both goals, designing new genetic switches and editing the genome, CRISPR system has been postulated as one of the greatest technological advances in the field of Synthetic Biology and has quickly become an indispensable tool both in this field and also in many other areas of Molecular Biology. Being easy and interchangeable through the choice of guide RNA sequence (gRNA) programming; as well as their orthogonality, feature granted by the specificity of this gRNA of 20bp complementary to the target sequence, are two of the most remarkable strengthens of this system. Furthermore, in recent years different DNA assembly systems have been developed based on the usage of interchangeable standardized genetic parts in order to obtain complex gene constructs. Thanks to these systems large parts collections are being developed in order to allow their usage for any purpose, with identical protocols, in any laboratory around the world. Thus, the standard modular design of new tools for the creation of genetic circuits or for gene editing is key to facilitate their access to everyone. In this work, the characterization of different new versions of the CRISPR system in plants has been carried out, thereby extending the range of possibilities. It has also been adapted its design to GoldenBraid3.0 standard, one of the most used in Plant Synthetic Biology.