Regulación de la expresión de la calpaína 2 en líneas celulares de cáncer de colon y su papel en la biogénesis ribosomal

Abstract

[ES] Las calpaínas (CAPNs) son una familia de cisteín proteasas dependientes de calcio. En concreto, la calpaína 2 (CAPN2), una de las isoformas mejor caracterizadas, es un heterodímero compuesto por dos subunidades de 30KDa y 80KDa. La CAPN2 participa en el procesamiento de múltiples proteínas, y se ha visto que su expresión aumenta en distintos tipos de cáncer. Sin embargo, aún no se ha establecido el papel de la CAPN2 en la progresión tumoral y su posible valor pronóstico. El modelo experimental empleado en la realización del presente trabajo de fin de grado son células de cáncer colorrectal con y sin mutaciones en KRAS. En resultados previos a mi incorporación, se demostró por inmunofluorescencia y western blot que la CAPN2 se encuentra en el nucléolo en células de cáncer colorrectal. Aunque se analizó la posible relación de la CAPN2 con la actividad nucleolar en estas líneas, no se observó una correlación entre la expresión de la CAPN2 y el tamaño o número de nucléolos. En extractos de proteína total de las líneas celulares, se observa un aumento de la CAPN2 en ausencia de nutrientes. Por otro lado, en extractos nucleolares de las líneas celulares se observa una doble banda reconocida por anticuerpos anti-CAPN2. En la base de datos del NCBI se encuentra la secuencia de una hipotética CAPN2 truncada, que todavía no ha sido validada experimentalmente. Pensamos que esa banda de unos 55-60KDa puede corresponder a esa CAPN2 truncada. Mediante análisis bioinformático se encontró homología total entre ambas calpaínas si sólo se tienen en cuenta los primeros 439 residuos de la clásica (lCAPN2). Además, se detectaron señales de localización nucleolar en la tCAPN2 que en la lCAPN2 se encuentran enmascaradas, aunque la secuencia es idéntica en esas regiones. El objetivo del presente trabajo de fin de grado es la identificación y localización de una nueva isoforma de calpaína 2 truncada (tCAPN2), y su posible papel junto con la lCAPN2 en la modulación del crecimiento celular en líneas celulares humanas de cáncer colorrectal. Mediante el diseño de primers específicos se amplificó por PCR y se secuenció esta forma truncada, identificándose como tCAPN2. Se observó que los niveles de expresión de la tCAPN2 varían en función del estado mutacional de KRAS. Las calpaínas regulan múltiples funciones dependiendo de la parte de la célula donde se encuentren. Sin embargo, no se sabe hasta la fecha la forma que tienen las calpaínas de entrar al nucléolo, lo cual complica aún más el estudio de su papel en ese orgánulo. Nuestros datos sugieren que el papel de la CAPN2 nucleolar en células tumorales podría ser el de reprimir la biogénesis ribosomal, ya que el nucléolo se compone principalmente de ADN ribosomal, además de otras proteínas.

[EN] Calpains (CAPNs) are a family of calcium-dependent cysteine proteases. In particular, CAPN2, one of the best-characterized isoforms, is an heterodimer consisting of two subunits of 30KDa and 80KDa. CAPN2 is involved in the cleavage of several proteins, and its expression increases in different types of cancer. However, CAPN2 role in tumor progression and its plausible prognosis value has not been stablished yet. The experimental model used in this Final Degree Project consists of colorectal cancer cells carrying or not KRAS mutations. In previous results, immunofluorescence and western blot analysis showed that CAPN2 is located at the nucleolus in colorectal cancer cells. Although the possible relation between CAPN2 and the nucleolar activity was analysed, no correlation was found between CAPN2 expression and the size or number of nucleoli. When analyzing CAPN2 total protein levels, an increase of CAPN2 levels is observed when there are no nutrients. Moreover, two bands of different size (recognized by anti-CAPN2 antibodies) were observed in any of the cell lines when analyzing this protease levels in the nucleoli. On the NCBI database, there is a nucleotide sequence of an hypothetical truncated form of CAPN2 (tCAPN2), which has not been characterized yet. We thought that this band (55-60 KDa approximately) could be the truncated CAPN2 isoform. We analyzed the homology between classical CAPN2 (lCAPN2) and tCAPN2, and we found that both sequences are identical if we only consider the first 439 amino acids of lCAPN2. Moreover, nucleolar localization signals were detected in tCAPN2 but not in lCAPN2, although the sequence is identical in the specific region where the signal is detected. The main goal of the present Final Degree Project is to identify and locate the truncated form of CAPN2 and its possible role (with the lCAPN2) in cellular growth in colorectal human cell lines. We designed specific primers in order to amplify and sequence the tCAPN2, and we were able to identify it as a new isoform. We observed that its expression levels are dependent on the mutational status of KRAS. Calpains are involved in a number of functions depending on the part of the cell they are located at. Nevertheless, it is not known why and when calpains translocate to the nucleolus. This fact makes even more difficult to study the role of calpains in the nucleolus. All in all, our data suggest that nucleolar CAPN2 could have a role in tumor cells, and this is to suppress ribosomal biogenesis, since the nucleolus consists essentially of ribosomal DNA and other proteins.