Genotipado de polimorfimos de un único nucleótido relacionados con el tratamiento con curmarinas de enfermedades cardiovasculares

Abstract

[ES] El acenocumarol ((RS)-4-hidroxi-3-[1-(4-nitrofenil)-3-oxobutil]cromen-2-ona) es un anticoagulante de la familia de las cumarinas comercializado como Sintrom. Su mecanismo de acción se basa en actuar como antagonista de la vitamina K, siendo su diana la enzima VKORC1. Este fármaco se administra en numerosos pacientes con problemas cardiovasculares. Sin embargo, existe una amplia variabilidad interindividual en la respuesta, por lo que el ajuste de la dosis es crítico para evitar episodios tromboembólicos o hemorragias. Dado que existen estudios farmacogenéticos que han demostrado la asociación con ciertas variaciones genéticas, es posible administrar una terapia más personalizada, mejorando la eficacia del tratamiento y reduciendo el daño generado por dosis incorrectas. El presente TFG está enfocado en apoyar el desarrollo de un dispositivo innovador y de altas prestaciones que permita el genotipado de polimorfismos de un único nucleótido relacionados con la farmacodinámica y farmacocinética del acenocumarol. La información obtenida permitirá administrar un tratamiento de acuerdo a la subpoblación alélica determinada. Las tareas de investigación se centran en la puesta a punto de dos estrategias alelo específicas para determinar la variante polimórfica rs9923231 del gen VKORC1, evaluando el efecto que posee el origen del tejido analizado en el ensayo. La recogida de muestras se realizó mediante métodos no invasivos y sencillos (epitelio bucal y cabello). La extracción de ADN genómico, en ambos casos, presentó unos rendimientos promedio adecuados (70 ng/µL y 14 ng/µL, respectivamente), así como buenos valores de pureza (A260/280≥ 1,80). La amplificación de la región diana y del gen endógeno mostró que no había diferencias significativas entre el ADN genómico de ambos orígenes. Respecto al método de discriminación entre subpoblaciones alélicas, la primera aproximación consistió en la amplificación utilizando cebadores alelo específicos tipo ARMS y posterior detección mediante técnicas de fluorescencia, electroforesis e hibridación. Particularmente, la detección basada en un ensayo de hibridación con sondas inmovilizadas en un chip, fue la estrategia que presentó mejor selectividad, discriminando el alelo nativo y mutante. Los resultados obtenidos en la asignación de los genotipos se correlacionaron totalmente con los resultados obtenidos mediante la técnica de referencia (secuenciación Sanger). La segunda aproximación consistió en la ligación alelo específica combinada con amplificación universal. Se han logrado avanzar en la generación de controles positivos y negativos y en el estudio del efecto que poseen las condiciones experimentales en el resultado del ensayo. Aunque la perfecta discriminación de las subpoblaciones no se ha logrado, los resultados muestran el potencial de esta estrategia. En conclusión, ambas aproximaciones de genotipado estudiadas son prometedores para su integración en un dispositivo transferible a un laboratorio clínico.

[EN] Acenocoumarol ((RS) -4-hydroxy-3- [1- (4-nitrophenyl) -3-oxobutyl] chromen-2-one) is a coumarin anticoagulant and commercialized as Sintrom. Its mechanism of action is based on vitamin K antagonism, its target is the enzyme VKORC1. It is administered to many patients with cardiovascular problems. However, the drug response has high interindividual variability, so dose adjustment is critical to avoid thromboembolic events or bleeding. Since there are several pharmacogenetic studies that have shown the important role played by genetic variations in acenocoumarol dose requirements, it is possible to use a more personalized that would be more efficient and less harming that the administration of inadequate doses. This bachelor thesis is focused on supporting the development of an innovative and high performance device that allows for the genotyping of single nucleotide polymorphisms related to the pharmacodynamics and pharmacokinetics of acenocoumarol. The achieved information will allow administering treatment for the specific allelic subpopulation. Research activities concentrates on the development of two allele-specific strategies to determine the polymorphic variant rs9923231 of VKORC1 gene, evaluating the effect on the origin of the tissue examined in the assay. Samples were collected using non-invasive and simple methods (buccal epithelium and hair). Genomic DNA extraction, in both cases, showed adequate avarege yields (70 ng/μL and 14 ng/μL, respectively) as well as good purity values (A260/280 ≥1,80). Amplification of the target region and the endogenous gene showed that there were no significant differences between the genomic DNA of both origins. In relation to the method of discrimination among allelic subpopulations, the first approach consisted of amplification using ARMS allele-specific primers and subsequent detection techniques like fluorescence measurement, agarose electrophoresis and hybridization. Particularly, the detection based on a hybridization assay with immobilized probes on a chip, was the strategy that presented better selectivity, discriminating the wild-type allele and mutant. The results obtained in genotypes’ assignment were totally correlated with the results obtained by reference technique (Sanger sequencing). The second approach was based on allele-specific ligation combined with universal amplification. Ligation’s progress has been made in the generation of positive and negative controls and in the studies on the effect of the experimental conditions on assay results. Although perfect discrimination of subpopulations has not been achieved, the results show the potential of this strategy. In conclusion, both studied approaches of genotyping are promising for their integration into a device transferable to a clinical laboratory.