Estudio de la dinámica poblacional de arqueas metanogénicas en un reactor anaerobio de membranas mediante PCR cuantitativa y métodos microscópicos y su relación con los parámetros operacionales

Abstract

[ES] Debido a las ventajas que presenta un sistema de tratamiento de aguas residuales basado en un reactor anaerobio de membrana sumergida, y dado que la monitorización de sistemas anaerobios se realiza mediante el estudio de los microorganismos que generan metano debido a su sensibilidad a inestabilidades en el proceso, el presente trabajo pretende estudiar en una planta piloto la dinámica poblacional de arqueas metanogénicas mediante diferentes técnicas moleculares y estudiar su relación con los parámetros operacionales del reactor. Para ello se estudió la presencia de arqueas y de arqueas metanogénicas (órdenes Methanobacteriales, Methanosarcinales, Methanomicrobiales y Methanococcales y gen mcrA), mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Posteriormente, se llevó a cabo una cuantificación de la población mediante PCR cuantitativa (qPCR) e hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH). Mediante qPCR el grupo predominante fue el orden Methanosarcinales, seguido de los órdenes Methanomicrobiales y Methanobacteriales. En los dos últimos órdenes, no se pudo obtener una cuantificación mediante FISH debido a la menor sensibilidad del método, dado que presentaban una concentración menor a un 1% respecto del total y la cuantificación resultaría imprecisa. En cuanto a las tendencias en la población de arqueas y del orden Methanosarcinales, éstas resultaron similares mediante ambas técnicas, lo que confirma la validez de los métodos desarrollados. Posteriormente, se observó que la población de arqueas y los órdenes estudiados se veía relacionada con algunas variables del proceso. En cuanto a la temperatura, las arqueas metanogénicas se ven favorecidas por un aumento de ésta, sobre todo el orden Methanomicrobiales. Esto es debido a que las reacciones biológicas se encuentran sensiblemente influidas por la temperatura, y en el caso de orden Methanomicrobiales, parece ser que presenta una mayor sensibilidad. Respecto a la producción de metano, se ha observado una relación con el gen mcrA, dado que es el gen que codifica la enzima que cataliza el paso final en la metanogénesis. A pesar de esto, se encuentran variaciones en la relación entre ambas variables, dado que mediante qPCR se mide identidad y no actividad de las arqueas metanogénicas. Por el contrario, parece ser que la población no se vea afectada por variaciones en los tiempos de retención celular e hidráulico (al menos en los rangos estudiados). Además, tampoco se ha encontrado relación con los sólidos volátiles, debido a que se encuentra presente en el reactor una elevada fracción volátil, la cual no corresponde únicamente a arqueas o bacterias. Debido a lo comentado anteriormente, resulta muy interesante estudiar comunidades metanogénicas para detectar cambios en reactores anaerobios mediante qPCR, dado que la técnica amplía la información obtenida mediante métodos más tradicionales (FISH) y es posible la monitorización de otros grupos más difíciles de detectar.

[CA] A causa dels avantatges que presenta un sistema de tractament d'aigües residuals basat en un reactor anaerobi de membrana submergida, i atès que la monitorització de sistemes anaerobis es realitza mitjançant l'estudi dels microorganismes que generen metà a causa de la seva sensibilitat a inestabilitats en el procés, el present treball pretén estudiar en una planta pilot la dinàmica poblacional de arqueges metanogèniques mitjançant diferents tècniques moleculars i estudiar la seua relació amb els paràmetres operacionals del reactor. Per a això es va estudiar la presència d'arqueges i d’arqueges metanogèniques (ordres Methanobacteriales, Methanosarcinales, Methanomicrobiales i Methanococcales i gen mcrA), mitjançant reacció en cadena de la polimerasa (PCR). Posteriorment, es va dur a terme una quantificació de la població mitjançant PCR quantitativa (qPCR) i hibridació in situ amb sondes fluorescents (FISH). Mitjançant qPCR el grup predominant va ser l'ordre Methanosarcinales, seguit dels ordres Methanomicrobiales i Methanobacteriales. En el cas dels dos últims ordres, no es va poder obtenir una quantificació mitjançant FISH a causa de la menor sensibilitat del mètode, ja que presentaven una concentració menor a un 1% respecte del total i la quantificació resultaria imprecisa. Pel que fa a les tendències en la població d’arqueges i de l'ordre Methanosarcinales, aquestes van resultar semblants mitjançant ambdues tècniques, el que confirma la validesa dels mètodes desenvolupats. Posteriorment, es va observar que la població d'arqueges i els ordres estudiats es veia relacionada amb algunes variables del procés. Pel que fa a la temperatura, les arqueges metanogèniques es veuen afavorides per un augment d'aquesta, sobre tot l'ordre Methanomicrobiales. Això és degut al fet que les reaccions biològiques es troben sensiblement influïdes per la temperatura, i en el cas d'ordre Methanomicrobiales, sembla ser que presenta una major sensibilitat. Respecte a la producció de metà, s'ha observat una relació amb el gen mcrA, degut a que és el gen que codifica l'enzim que catalitza el pas final a la metanogènesi. Tot i això, es troben variacions entre les variables, atès que mitjançant qPCR es mesura identitat i no activitat de les arqueges metanogèniques. Per contra, sembla ser que la població no es veu afectada per variacions en els temps de retenció cel’lular i hidràulic (almenys en els rangs estudiats). A més, tampoc s'ha trobat relació amb els sòlids volàtils, perque es troba present en el reactor una elevada fracció volàtil, la qual no correspon únicament a arqueges o bacteris. A causa del comentat anteriorment, resulta molt interessant estudiar comunitats metanogèniques per detectar canvis en reactors anaerobis mitjançant qPCR, atès que la tècnica amplia la informació obtinguda mitjançant mètodes més tradicionals (FISH) i és possible el monitoratge d'altres grups més difícils de detectar.

[EN] Due to the advantages of a wastewater treatment system based on an anaerobic submerged membrane reactor, and given that the monitoring of anaerobic systems is performed by studying the microorganisms that generate methane due to their sensitivity to process instabilities , the present work intends to study in a pilot plant the population dynamics of methanogenic archaea by different molecular techniques and to study its relation with the operational parameters of the reactor. The presence of archaea and methanogenic archaea (Methanobacteriales, Methanosarcinales, Methanomicrobiales and Methanococcales orders and mcrA gene) were studied by polymerase chain reaction (PCR). Subsequently, a quantification of the population was carried out using quantitative PCR (qPCR) and fluorescent in situ hybridization (FISH). Using qPCR the predominant group was the order Methanosarcinales, followed by the orders Methanomicrobiales and Methanobacteriales. In the last two cases, the quantification could not be obtained by FISH due to the lower sensitivity of the method, given that they had a concentration less than a 1% of the total and the quantification would be inaccurate. In terms of the trends in the population of archaea and the order Methanosarcinales, these were similar by both techniques, which confirms the validity of the methods developed. Subsequently, it was observed that the population of archaea and the orders studied was related to some variables of the process. In terms of temperature, methanogenic archaea are favored by an increase of this, especially the order Methanomicrobiales. This is due to the fact that biological reactions are sensitively influenced by temperature, and in the case of Methanomicrobial order, it seems to be more sensitive. Regarding the production of methane, a relationship with the mcrA gene has been observed, since it is the gene that encodes the enzyme that catalyzes the final step in methanogenesis. In spite of this, variations in the relationship between both variables are found, because qPCR measures the identity and not the activity of methanogenic archaea. On the contrary, it seems that the population is not affected by variations in the cellular and hydraulic retention times (at least in the ranges studied). Also, no relation has been found with the volatile solids, because a high volatile fraction is present in the reactor, which does not only correspond to archaea or bacteria. Due to the aforementioned, it is very interesting to study methanogenic communities to detect changes in anaerobic reactors by qPCR, since the technique expands the information obtained through more traditional methods (FISH) and it is possible to monitoring other groups more difficult to detect.