El papel de las proteínas DELLA en el procesamiento alternativo de mensajeros

Abstract

DELLA proteins, the master repressors of the gibberellin (GA) signaling pathway, are thought to regulate gene expression by mechanisms other than their interaction with bona fide transcription factors. In particular, current work in our lab shows that DELLA and their atypical interactors prefoldins are able to interact with and regulate a number of proteins that are part of the basal transcriptional machinery, regulating the RNA polymerase II activity. Among the novel interactors being studied are proteins involved in mRNA splicing. In this TFM, we have investigated the participation of DELLA and prefoldin in alternative splicing by analyzing protein-protein interaction between these proteins and Sm/LSm, which form heteroheptameric complexes and are an essential part of the spliceosome. We have also advanced in obtaining resources to test genetic interactions between della and sm/lsm mutants. In addition, some alternative splicing events affected by DELLA activity identified in a transcriptomic analysis by RNA-seq, have been validated by semiquantitative RT-PCR. Finally, it has been shown that GA signaling alters the Sm and LSm protein levels.

En el laboratorio se está investigando los mecanismos moleculares por los que las proteínas DELLA regulan la expresión génica en plantas. El mecanismo aceptado en la actualidad indica que esta regulación ocurre a través de la interacción de las DELLA con numerosos factores de transcripción. No obstante, resultados recientes del laboratorio apuntan a mecanismos alternativos de regulación génica por parte de estas proteínas. Una de las claves fue la identificación de la interacción de las DELLA con el complejo prefoldina. Este complejo heterohexamérico (PFD1-6) está conservado de levaduras a humanos y se aisló originalmente gracias a su papel en el citoplasma, donde ejerce de co-chaperona ayudando en el plegamiento de tubulinas. En el laboratorio se ha demostrado que las DELLA promueven la acumulación en el núcleo del complejo y los últimos resultados apuntan a que puede tener un papel relevante en la regulación génica. En particular, hemos demostrado que tanto las DELLA como varias subunidades prefoldina interaccionan con varias proteínas Sm y LSM. Las proteínas Sm y LSM forman las 5 snRNP (del inglés, small nuclear ribonucleoprotein particles) del espliceosoma junto con UsnRNA (RNA pequeños nucleares ricos en uridina). Por un lado, las proteínas LSM forman dos tipos de heteroheptámeros (LSM1-7 y LSM2-8), siendo el primero citosólico y participando en el decaimiento de los mRNA mientras que el segundo se localiza en el núcleo estabilizando al snRNA U6. Por otro lado, las otras 4 snRNP, están formadas por un anillo de 7 proteínas Sm (B, D1, D2, D3, E, F y G) y 4 snRNA diferentes (U1, U2, U4 y U5). Además, se ha demostrado que la pérdida de función de PFD provoca alteración en los niveles de U6. Mediante un RNAseq se comprobó que los mutantes pfd4 mostraban fenómenos de procesamiento alternativo de mensajeros (splicing alternativo) diferentes al silvestre tras un tratamiento de frío. Por lo tanto, proponemos que las DELLA pueden tener un rol directo en el procesamiento alternativo. En el contexto de este TFM vamos a evaluar el efecto de DELLA y prefoldinas en el procesamiento alternativo de mensajeros mediante la comprobación de la interacción proteína-proteína entre DELLA y Sm/LSM, y PFD y Sm; tanto por técnicas de doble híbrido como Co-IP. De igual manera, se comprobarán las interacciones genéticas entre mutantes della y sm/lsm. También se confirmarán dianas de splicing alternativo, obtenidas mediante un RNAseq, con PCR cuantitativa o semi-cuantitativa. Finalmente se estudiará si las giberelinas alteran la localización y/o la configuración de los complejos Sm y/o LSM2-8 mediante análisis en el microscopio confocal y cromatografía de exclusión molecular, respectivamente. Los análisis se realizarán en varios fondos mutantes y líneas transgénicas que tienen niveles alterados de DELLA, y en una serie de mutantes pfd preparados en el laboratorio, de manera que podremos diseccionar genéticamente la contribución de las DELLA y PFD.