Estudio de la regulación transcripcional del promotor de la proteína metalotioneína de tipo 2B mediante el sistema CRISPR/Cas9 en Nicotiana benthamiana

Abstract

[EN] The discovery of CRISPR/Cas system has meant a revolution in the synthetic biology field. Among all its applications, it could be found the genomic engineering or programmable transcriptional modulation. In this work, we have tried to modulate the expression of the Solanum lycopersicum Metallothionein-like protein type 2B promoter with the CRISPR/Cas9 system in Nicotiana benthamiana. Two different strategies have been developed in order to optimize the transcriptional regulation system in transient expression as much as in stable expression. The first strategy consists in fusing different activation and repression domains to dCas9 in C-terminal. On the other hand, the second one consists in the modification of the structure of RNA guide, which is joined with dCas9, in order to be recognized by MS2 virus coat protein. This protein has been fused to different activation and repression domains, allowing for a combinatorial action between domains fused to dCas9 and the ones linked to the complex through MS2.

[ES] El descubrimiento del sistema CRISPR/Cas ha supuesto una revolución para el campo de la biología sintética, ya que entre sus múltiples aplicaciones se encuentran el editado genómico y la regulación transcripcional programable. En el presente trabajo se ha tratado de modular la expresión del promotor de la proteína metalotioneína de tipo 2B (MTB) de Solanum lycopersicum utilizando el sistema CRISPR/dCas9 en Nicotiana benthamiana. Se han desarrollado dos estrategias diferentes con el fin de optimizar el sistema de regulación transcripcional tanto en expresión transitoria como en estable. Por un lado, la fusión de distintos dominios de activación y represión a dCas9 en C-terminal. Por otro lado, se ha modificado la estructura del guía de ARN que se une a dCas9, para que sea reconocido por la proteína de la cápsula del virus MS2. Esta proteína se ha fusionado también a diferentes dominios de activación y represión, permitiendo una acción combinatoria entre los dominios fusionados a dCas9 y los unidos al complejo mediante MS2.