Identificación y variabilidad molecular de virus en el cultivo de zanahoria en Segovia

Abstract

[ES] La zanahoria (Daucus carota L.) es considerada la hortaliza más importante y de mayor consumo de la familia de las apiáceas, debido a su elevado contenido en vitaminas A, B y C, y su gran valor antioxidante. Segovia es una de las provincias españolas donde el cultivo de zanahoria es mayoritario y en la que se vienen observando problemas fitosanitarios de posible etiología viral desde hace varias campañas. Por ello, la Asociación para la Protección Fitosanitaria del Puerro, la Zanahoria y la Cebolla (ASOPROFIT) de Castilla y León en colaboración con el Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León (ITACyL) firmaron una Prestación de Servicios con el Laboratorio de Virología del Instituto Agroforestal Mediterráneo de la Universitat Politècnica de València para determinar los posibles virosis implicadas en los problemas fitosanitarios de este cultivo. Concretamente, el objetivo de este trabajo era determinar la presencia en campo de los principales virus que afectan al cultivo de zanahoria, entre los que se encuentran Cucumber mosaic virus (CMV), Carrot red leaf virus (CtRLV) y miembros del género Umbravirus asociados a este último: Carrot mottle virus (CMoV) y Carrot mottle mimic virus (CMoMV), así como a Carrot red leaf associated RNA virus (CtRLVaRNA). Se tomaron 50 muestras vegetales sintomáticas recogidas de 8 localidades de la zona afectada y se analizaron mediante la técnica serológica (DAS-ELISA) a CMV y Potyvirus general y mediante la técnica molecular RT-PCR para la detección de CtRLV, CMoV, CMoMV y CtRLVaRNA. De todos los virus analizados se detectaron principalmente CtRLV, CMoV, CtRLVaRNA (en 32 de las 50 muestras analizadas) presentes en todas las localidades muestreadas. En menor medida, se detectó CMoMV (20% de las muestras analizadas). No se detectó ni CMV ni ninguna especie del género Potyvirus. Las muestras presentaban generalmente infecciones mixtas, no solo de virus sino también con ˋCandidatus Liberibacter solanacearum´ (CaLsol), lo que hacía imposible asociar la sintomatología observada con el organismo presente en la muestra. Por otro lado, se seleccionaron 9 aislados de CtRLV procedentes de diferentes zonas españolas muestreados en distintos años y se secuenciaron dos fragmentos diferentes del gen que codifica la RNA-polimerasa RNA-dependiente del virus. El análisis BLAST de secuencias determinó que todas presentaban una alta identidad nucleotídica (93-99%) comparándolas con aislados publicados en la base de datos del GenBank procedentes de Reino Unido. Los análisis filogenéticos mostraron que los aislados españoles, en general, se agrupaban conjuntamente en un subgrupo diferente al de los aislados ingleses, aunque aparecían algunas secuencias de aislados españoles que diferían del resto.

[EN] The carrot (Daucus carota L.) is considered the most important and most consumed vegetable of the Apiaceae family, due to its high content of vitamins A, B and C, and its great antioxidant value. Segovia is one of the Spanish provinces where there is a huge cultivation of carrots and in which phytosanitary problems of possible viral etiology have been observed for several campaigns. For this reason, the Association for the Phytosanitary Protection of Leeks, Carrots and Onions (ASOPROFIT) of the Community of Castilla y León in collaboration with the Agricultural Technology Institute of Castilla y León (ITACyL) signed a Service Delivery with the Laboratory of Virology of the Mediterranean Agroforestry Institute of the Universitat Politècnica de València to determine the possible viruses involved in the phytosanitary problems of this crop. Specifically, the objective of this work was to determine the presence in the field of the main viruses that affect the carrot crop, such as Cucumber mosaic virus (CMV), Carrot red leaf virus (CtRLV) and members of the genus Umbravirus associated with the latter: Carrot mottle virus (CMoV) and Carrot mottle mimic virus (CMoMV), as well as Carrot red leaf associated RNA virus (CtRLVaRNA). A total of 50 symptomatic plant samples were collected from 8 different localities of the affected area and were analyzed by the serological technique DAS-ELISA to CMV and general Potyvirus and through the molecular technique RT-PCR for the detection of CtRLV, CMoV, CMoMV and CtRLVaRNA . Of all the viruses analyzed, CtRLV, CMoV, CtRLVaRNA were detected in all the sampled localities (in 32 of the 50 analyzed samples). To a lesser extent, CMoMV was detected (20% of the samples analyzed). No CMV or any species of the genus Potyvirus were detected. The samples generally had mixed infections, not only of virus but also with 'Candidatus Liberibacter solanacearum' (CaLsol), which made it impossible to associate the observed symptoms with the present organism in the sample. On the other hand, 9 CtRLV isolates from different Spanish areas sampled in different years were selected and two different fragments of the RNA-polymerase RNAdependent coding gene were sequenced. The BLAST analysis of sequences determined that all had a high nucleotide identity (93-99%) compared with isolates published in the GenBank database from the United Kingdom. The phylogenetic analysis showed that the Spanish isolates in general were grouped together in a different subgroup from the English isolates, although some sequences of Spanish isolates differed from the rest.

[CA] La carlota (Daucus carota L.) és considerada l'hortalissa més important i de major consum de la família de les apiáceas, a causa del seu elevat contingut en vitamines A, B i C, i el seu gran valor antioxidant. Segòvia és una de les províncies espanyoles on el cultiu de carlota és majoritari i en la que es vénen observant problemes fitosanitaris de possible etiologia viral des de fa diverses campanyes. Per això, l'Associació per a la Protecció Fitosanitària del Porro, la Carlota i la Ceba (ASOPROFIT) de Castella i Lleó en col·laboració amb l'Institut Tecnològic Agrari de Castella i Lleó (ITACyL) van firmar una Prestació de Servicis amb el Laboratori de Virologia de l'Institut Agroforestal Mediterrani de la Universitat Politècnica de València per a determinar les possibles virosis implicades en els problemes fitosanitaris d'este cultiu. Concretament, l'objectiu d'este treball era determinar la presència en camp dels principals virus que afecten el cultiu de carlota, entre els que es troben Cucumber mosaic virus (CMV), Carrot red leaf virus (CtRLV) i membres del gènere Umbravirus associats a este últim: Carrot mottle virus (CMoV) i Carrot mottle mimic virus (CMoMV), així com a Carrot red leaf associated RNA virus (CtRLVaRNA). Es van prendre 50 mostres vegetals simptomàtiques arreplegades de 8 localitats de la zona afectada i es van analitzar per mitjà de la tècnica serológica (DAS-ELISA) a CMV i Potyvirus general i per mitjà de la tècnica molecular RT-PCR per a la detecció de CtRLV, CMoV, CMoMV i CtRLVaRNA. DE tots els virus analitzats es van detectar principalment CtRLV, CMoV, CtRLVaRNA (en 32 de les 50 mostres analitzades) presents en totes les localitats mostrejades. En menor grau, es va detectar CMoMV (20% de les mostres analitzades). No es va detectar ni CMV ni cap espècie del gènere Potyvirus. Les mostres presentaven generalment infeccions mixtes, no sols de virus sinó també amb `Candidatus Liberibacter solanacearum´ (CaLsol), la qual cosa feia impossible associar la simptomatologia observada amb l'organisme present en la mostra. D'altra banda, es van seleccionar 9 aïllats de CtRLV procedents de diferents zones espanyoles mostrejats en distints anys i es van seqüenciar dos fragments diferents del gen que codifica la RNApolimerasa RNA-dependent del virus. L'anàlisi BLAST de seqüències va determinar que totes presentaven una alta identitat nucleotídica (93-99%) comparant-les amb aïllats publicats en la base de dades del GenBank procedents de Regne Unit. Els anàlisis filogenètics van mostrar que els aïllats espanyols en general s'agrupaven conjuntament en un subgrup diferent del dels aïllats anglesos, encara que apareixien algunes seqüències d'aïllats espanyols que diferien de la resta.