Resumen:
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[ES] Las enfermedades cardiovasculares (ECV) constituyen la principal causa de muerte en la
unión europea, representando un 40% de los fallecimientos totales. Es por ello que disponer
de dispositivos para su diagnóstico ...[+]
[ES] Las enfermedades cardiovasculares (ECV) constituyen la principal causa de muerte en la
unión europea, representando un 40% de los fallecimientos totales. Es por ello que disponer
de dispositivos para su diagnóstico clínico rápidos, y que actúen en el punto de necesidad es
una de las demandas crecientes en el segmento de mercado de los dispositivos de tipo “pointof-care”
(POC).
Los biomarcadores cardíacos que se encuentran en el torrente sanguíneo comprenden
distintas proteínas cuyas concentraciones son muy variables, yendo desde ng/L, como es el
caso de la Troponina cardíaca I, hasta mg/L, como es el caso de la proteína C-reactiva.
Los ensayos en formato heterogéneo, en los cuales los analitos son reconocidos por
elementos de captura específicos inmovilizados sobre un soporte sólido, son especialmente
interesantes en los dispositivos POC. En este tipo de ensayos es necesaria la inmovilización
eficiente de las sondas de captura sobre el soporte, y el tipo de inmovilización preferida suele
ser el enlace covalente. Los soportes sólidos pueden actuar bien como transductor o bien
como soporte inerte. De entre los formatos heterogéneos, el formato de micromatriz y las
tecnologías de sensado basadas en óptica integrada resultan de gran interés, las primeras
por su alta capacidad de trabajo y las segundas por la posibilidad de trabajar en ausencia de
marcaje y con alta sensibilidad.
El presente trabajo plantea la puesta a punto de un sistema heterogéneo para detectar
mioglobina, que es biomarcador cardiaco, sobre un soporte de vidrio con el fin de realizar
detección fluorescente en formato micromatriz, y trasladarlo posteriormente a materiales en
base silicio para su aplicación en sensado nanofotónico sin marcaje.
Por ello, se propone la reducción selectiva de anticuerpos contra mioglobina, su
inmovilización y la puesta a punto del inmunoensayo en micromatriz con detección
fluorescente, tanto en formato directo como en formato sándwich. Posteriormente, las
condiciones optimizadas en formato micromatriz se transferirán a un dispositivo de óptica
integrada para demostrar el sensado sin necesidad de marcaje. Para el anclaje de los
anticuerpos responsables del reconocimiento se utilizará una reacción fotoinducida
consistente en el acoplamiento entre grupos tiol del anticuerpo, previamente reducido en su
región bisagra, y grupos alqueno de la superficie.
Los ensayos realizados demuestran que la irradiación a λ = 254 nm es necesaria para la
fijación de las medias inmunoglobulinas G (hIgG) a la superficie funcionalizada mediante la
reacción del tiol-eno. Además, se comprueba que con las hIgGs se alcanza el doble de
sensibilidad que con las inmunoglobulinas G (IgGs) enteras. Finalmente, se determina la
sensibilidad del sistema, siendo de 0,001 μg/mL en el formato directo.
Los resultados de este trabajo se espera que contribuyan al diseño de un dispositivo POC,
con detección basada en tecnología nanofotónica, que se está desarrollando en el grupo en
el marco de un proyecto europeo del programa H2020 denominado PHOCNOSIS (H2020-
PHC-634013, Advanced nanophotonic point-of-care analysis device for fast and early
diagnosis of cardiovascular diseases).
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[EN] Cardiovascular diseases constitute the main death cause in the European Union, representing
40% of total deaths. It is for that reason that having devices for their quick clinic diagnosis and
that they act in the ...[+]
[EN] Cardiovascular diseases constitute the main death cause in the European Union, representing
40% of total deaths. It is for that reason that having devices for their quick clinic diagnosis and
that they act in the exact needed location is one of the most increasing claims in the market
sector of point-of-care (POC) devices.
Cardiac biomarkers that are found in the bloodstream comprise different proteins of which
concentrations are very variable, covering from ng/L, so as cardiac troponin 1, to mg/L, so as
C-reactive protein.
Heterogeneous format assays, in which analytes are recognised by specific capture elements,
immobilised in a solid support, are specially interesting in POC devices. In this kind of assays,
the efficient immobilisation of the probes in the support is needed, and the preferred
immobilisation way is used to be covalent binding. Solid surfaces can act as transductor or
also as inert surface. Among heterogeneous formats, the micromatrix format and technologies
based on integrated optic sensing turn out to be really interesting, the first ones because of
their high working capacity, and the second ones due to the possibility of working in absence
of any labelling method and with high sensitivity.
The current work contemplates the set-up of a heterogeneous system to detect myoglobin,
which is a cardiac biomarker protein, over a glass surface, to develop an immunoassay with
fluorescent detection in micromatrix format, and its further transferring into silica-based
materials for its application in non-labelling nanophotonic sensing.
Thus, it is proposed the selective reduction of anti-myoglobin antibodies, their immobilisation
and the setup of the immunoassay in micromatrix format using fluorescent detection, both in
direct and sandwich forms. Afterwards, the optimised conditions in micromatrix format will be
transferred into an integrated optic device in order to demonstrate the label free sensing. The
antibodies which are responsible for the recognition will be anchored to the surface by means
of a photoinduced reaction which consists of the coupling between the antibody thiol groups,
which have been previously reduced in their hinge region, and alkene groups located in the
surface.
The assays demonstrate that the irradiation at λ = 254 nm is necessary for the fixation of the
half immunoglobulins G (hIgGs) to the functionalized surface by means of the thiol-ene
reaction. Furthermore, it is proved that with hIgGs the achieved sensibility is two times higher
than the one obtained with the entire immunoglobulins G (IgGs). Finally, the sensitivity of the
system is determined as 0.001 μg/mL in the direct format.
It is expected that the results of this work would contribute to the design of a POC device, with
nanophotonic technology based detection, which is currently being developed in the group in
a European project framework of the Horizon2020 programme named PHOCNOSIS (H2020-
PHC-634013, Advanced nanophotonic point-of-care analysis device for fast and early
diagnosis of cardiovascular diseases).
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