Reducción selectiva de anticuerpos para su anclaje a soportes sólidos mediante la reacción de acoplamiento tiol-eno. Aplicación a la detección de Mioglobina con y sin marcaje

Abstract

[ES] Las enfermedades cardiovasculares (ECV) constituyen la principal causa de muerte en la unión europea, representando un 40% de los fallecimientos totales. Es por ello que disponer de dispositivos para su diagnóstico clínico rápidos, y que actúen en el punto de necesidad es una de las demandas crecientes en el segmento de mercado de los dispositivos de tipo “pointof-care” (POC). Los biomarcadores cardíacos que se encuentran en el torrente sanguíneo comprenden distintas proteínas cuyas concentraciones son muy variables, yendo desde ng/L, como es el caso de la Troponina cardíaca I, hasta mg/L, como es el caso de la proteína C-reactiva. Los ensayos en formato heterogéneo, en los cuales los analitos son reconocidos por elementos de captura específicos inmovilizados sobre un soporte sólido, son especialmente interesantes en los dispositivos POC. En este tipo de ensayos es necesaria la inmovilización eficiente de las sondas de captura sobre el soporte, y el tipo de inmovilización preferida suele ser el enlace covalente. Los soportes sólidos pueden actuar bien como transductor o bien como soporte inerte. De entre los formatos heterogéneos, el formato de micromatriz y las tecnologías de sensado basadas en óptica integrada resultan de gran interés, las primeras por su alta capacidad de trabajo y las segundas por la posibilidad de trabajar en ausencia de marcaje y con alta sensibilidad. El presente trabajo plantea la puesta a punto de un sistema heterogéneo para detectar mioglobina, que es biomarcador cardiaco, sobre un soporte de vidrio con el fin de realizar detección fluorescente en formato micromatriz, y trasladarlo posteriormente a materiales en base silicio para su aplicación en sensado nanofotónico sin marcaje. Por ello, se propone la reducción selectiva de anticuerpos contra mioglobina, su inmovilización y la puesta a punto del inmunoensayo en micromatriz con detección fluorescente, tanto en formato directo como en formato sándwich. Posteriormente, las condiciones optimizadas en formato micromatriz se transferirán a un dispositivo de óptica integrada para demostrar el sensado sin necesidad de marcaje. Para el anclaje de los anticuerpos responsables del reconocimiento se utilizará una reacción fotoinducida consistente en el acoplamiento entre grupos tiol del anticuerpo, previamente reducido en su región bisagra, y grupos alqueno de la superficie. Los ensayos realizados demuestran que la irradiación a λ = 254 nm es necesaria para la fijación de las medias inmunoglobulinas G (hIgG) a la superficie funcionalizada mediante la reacción del tiol-eno. Además, se comprueba que con las hIgGs se alcanza el doble de sensibilidad que con las inmunoglobulinas G (IgGs) enteras. Finalmente, se determina la sensibilidad del sistema, siendo de 0,001 μg/mL en el formato directo. Los resultados de este trabajo se espera que contribuyan al diseño de un dispositivo POC, con detección basada en tecnología nanofotónica, que se está desarrollando en el grupo en el marco de un proyecto europeo del programa H2020 denominado PHOCNOSIS (H2020- PHC-634013, Advanced nanophotonic point-of-care analysis device for fast and early diagnosis of cardiovascular diseases).

[EN] Cardiovascular diseases constitute the main death cause in the European Union, representing 40% of total deaths. It is for that reason that having devices for their quick clinic diagnosis and that they act in the exact needed location is one of the most increasing claims in the market sector of point-of-care (POC) devices. Cardiac biomarkers that are found in the bloodstream comprise different proteins of which concentrations are very variable, covering from ng/L, so as cardiac troponin 1, to mg/L, so as C-reactive protein. Heterogeneous format assays, in which analytes are recognised by specific capture elements, immobilised in a solid support, are specially interesting in POC devices. In this kind of assays, the efficient immobilisation of the probes in the support is needed, and the preferred immobilisation way is used to be covalent binding. Solid surfaces can act as transductor or also as inert surface. Among heterogeneous formats, the micromatrix format and technologies based on integrated optic sensing turn out to be really interesting, the first ones because of their high working capacity, and the second ones due to the possibility of working in absence of any labelling method and with high sensitivity. The current work contemplates the set-up of a heterogeneous system to detect myoglobin, which is a cardiac biomarker protein, over a glass surface, to develop an immunoassay with fluorescent detection in micromatrix format, and its further transferring into silica-based materials for its application in non-labelling nanophotonic sensing. Thus, it is proposed the selective reduction of anti-myoglobin antibodies, their immobilisation and the setup of the immunoassay in micromatrix format using fluorescent detection, both in direct and sandwich forms. Afterwards, the optimised conditions in micromatrix format will be transferred into an integrated optic device in order to demonstrate the label free sensing. The antibodies which are responsible for the recognition will be anchored to the surface by means of a photoinduced reaction which consists of the coupling between the antibody thiol groups, which have been previously reduced in their hinge region, and alkene groups located in the surface. The assays demonstrate that the irradiation at λ = 254 nm is necessary for the fixation of the half immunoglobulins G (hIgGs) to the functionalized surface by means of the thiol-ene reaction. Furthermore, it is proved that with hIgGs the achieved sensibility is two times higher than the one obtained with the entire immunoglobulins G (IgGs). Finally, the sensitivity of the system is determined as 0.001 μg/mL in the direct format. It is expected that the results of this work would contribute to the design of a POC device, with nanophotonic technology based detection, which is currently being developed in the group in a European project framework of the Horizon2020 programme named PHOCNOSIS (H2020- PHC-634013, Advanced nanophotonic point-of-care analysis device for fast and early diagnosis of cardiovascular diseases).