Caracterización funcional de un nuevo SNP asociado a la Discinesia Paroxística Cinesigénica Familiar

Abstract

[ES] La Discinesia Paroxística Cinesigénica Familiar (PKD, por sus siglas en inglés) es un trastorno neurológico de herencia autosómica dominante, caracterizado por episodios de movimiento anormal que van de leves a graves. Su aparición se suele dar en la infancia o la adolescencia, con un pico en la pubertad. Puede ser causada por mutaciones en el gen PRRT2 (proteína transmembrana rica en prolina 2) del cromosoma 16p11. La proteína codificada por este gen está formada por un dominio citoplasmático, uno transmembrana y otro extracelular. Su función es desconocida, aunque se piensa que puede estar involucrada en el desarrollo y funcionamiento del cerebro, interaccionando con proteínas que ayudan a controlar la liberación presináptica de neurotransmisores. Una señalización neuronal anormal causada por la proteína mutada podría provocar los problemas de movimiento asociados a la enfermedad. Se realizó un estudio genético mediante secuenciación del exoma completo usando el secuenciador HiSeq 4000 (Illumina) en muestras de ADN de tres pacientes de PKD. Las variantes no sinónimas fueron verificadas por secuenciación Sanger y los cambios que parecieron a priori más interesantes fueron además examinados por PCR específica de alelo en una población control y todos los miembros de la familia ( afectos y no afectos) disponibles. Las variantes encontradas en PRRT2 fueron seleccionadas como las más interesantes debido a que este gen ha sido asociado previamente con la PKD. La PCR específica de alelo mostró que el cambio estaba presente en el 100% de los miembros de la familia afectados por la enfermedad y en ninguno de los individuos sanos. Esta variante genética introduce un codón de parada, que podría causar una degradación del ARN mensajero (ARNm) mediada por una mutación terminadora, o bien una proteína truncada inestable o con su función alterada. En este proyecto se abordará el estudio del efecto que la nueva mutación produce en la expresión o función de la proteína, para intentar explicar las causas de la enfermedad a nivel molecular. Para ello se utilizará una fusión de PRRT2 con el epítopo Flag, amplificando PRRT2 y sus variantes por PCR hasta las posiciones de la nueva mutación y dos previamente descritas que también introducen codones de parada para verificar si siguen el mismo mecanismo. Tras la subclonación y la verificación de los plásmidos por secuenciación de Sanger, se introducirán en células SH-SY5Y mediante transfección transitoria con lipofectamina. En las células transfectadas se analizarán los niveles de ARNm de las variantes (silvestre y mutadas) por PCR cuantitativa, para determinar si el ARNm mutado se degrada por la ruta mediada por una mutación terminadora. Si los resultados muestran niveles normales de ARNm, se analizarán los niveles de proteína por Western-blot. En caso de no estar alterados los niveles de proteína, se realizará un experimento de pulso y caza con cicloheximida, parando el proceso de traducción y tomando muestras a diferentes tiempos para analizar la velocidad de degradación de las diferentes formas de la proteína. Esto nos permitiría comparar la estabilidad de la proteína silvestre con la de las mutadas, pudiendo así determinar si la causa de la enfermedad es la inestabilidad de las formas mutadas. Por último, si los niveles de ARNm y proteína no están alterados en la nueva forma mutada de la proteína, se estudiará si está alterada su función. Para ello se comprobará si interacciona con proteínas con las que se ha descrito previamente que interacciona la forma silvestre (SNAP-25, Syt1 y Syt2), mediante co-inmunoprecipitación. También puede estudiarse si está alterada la correcta localización celular (membrana plasmática), mediante inmunocitoquímica y fraccionamiento celular utilizando anticuerpos contra el epítopo Flag (PRRT2) y contra proteínas marcadoras de membrana plasmática y de los diferentes orgánulos celulares.

[EN] Familial paroxysmal kinesigenic dyskinesia (PKD) is an autosomal dominant neurologic disorder characterized by episodes of abnormal movement that range from mild to severe. Onset of the disorder usually coincides with childhood or early adulthood with a peak during puberty. PKD can be caused by mutations in the PRRT2 (proline rich transmembrane protein 2) gene on chromosome 16p11. The protein expressed by this gene consists of a cytoplasmatic, a transmembrane and an extracellular domain. The function of the protein is unknown, although it is thought to be involved in development and functioning of the brain, interacting with proteins that help control signalling between neurons. PRRT2 mutations probably lead to abnormal neuronal signalling, and this altered neuronal activity could underlie the movement problems associated with familial PKD. A genetic study was performed by whole exome sequencing using HiSeq 4000 sequencer (Illumina) with DNA samples of 3 patients with PKD. Nonsynonymous variants were verified by Sanger sequencing, and the most interesting genetic changes were examined by allele specific PCR in unaffected population control. A new variant found in PRRT2 was selected as the most interesting, as this gene was previously associated with PKD. Allele specific PCRs revealed that the variant was present in 100% of the family members affected by the disease and in none of the healthy individuals. This mutation introduces a stop codon, possibly causing a nonsense-mediated mRNA decay (NMD), an unstable truncated protein, or a protein functionally altered. This project will study the effect that this novel variant has on the expression or function of the protein, in an effort to explain the disorder at molecular level. For this purpose, a fusion of PRRT2 with Flag epitope was used, introducing the novel variant and two PKDcausing previously described mutations, which also introduce a stop codon, by PCR amplification. After subcloning and verification of the plasmids by Sanger sequencing, the plasmids were transiently lipofected in SH-SY5Y cell line. The mRNA levels in the variants (wild type and mutants) will be analyzed by quantitative PCR (qPCR), to determine whether the mutant mRNA is degraded by nonsense-mediated mRNA decay. If the qPCR shows no difference in mRNA levels, the protein levels will be assessed by Western blot. In case the protein levels are not being altered, a pulse-chase experiment with cycloheximide will be performed, stopping translation and collecting samples at different times to analyse degradation rate of different forms of the protein. This will allow to compare the stability between the wild type and mutant proteins, to further determine whether the cause of the disorder lies in the instability of the mutated forms. Finally, if the levels of mRNA and the protein are not altered in the mutant protein, its function will be examined. Co-Immunoprecipitation will be used to verify whether it interacts with proteins previously described as interacting with the wild type form (SNAP-25, Syt1 y Syt2). In addition, a study of the correct cellular localisation (plasma membrane) can be performed by immunocytochemistry and cell fractionation using antibodies against Flag epitope (PRRT2) and against plasma membrane and different organelles marker proteins.