Diseño de un protocolo de conservación de microbiota intestinal humana para uso en ensayos de fermentación colónica

Abstract

[ES] La microbiota intestinal, en su correcta homeostasis, lleva a cabo numerosas funciones que son esenciales para el individuo y que contribuyen en el metabolismo de este. Esta microbiota varía enormemente entre individuos, y en caso de desequilibrio pueden llegar a producirse diferentes patologías. Los estudios in vitro de la fermentación de las heces humanas pueden ayudar a determinar cómo afectan diferentes sustancias en la modulación de la microbiota intestinal y en los últimos años, han cobrado especial importancia los estudios para el trasplante de heces como tratamiento para diferentes patologías. En los estudios in vitro de fermentación colónica, en la actualidad, el principal problema radica en que dichos estudios se llevan a cabo con heces humanas frescas, habiendo gran variabilidad entre muestras, lo que hace que la reproducibilidad de los resultados en diferentes ensayos no sea posible. Es por esto que, en el presente proyecto, se tuvo como objetivo principal, el diseño y desarrollo de un protocolo para la conservación de los microorganismos que forman parte de la microbiota intestinal humana. Para ello, se preparó una muestra de heces previamente diluida en medio tioglicolato, con cuatro tratamientos de conservación diferentes: sin ningún tratamiento, DMSO 8%, DMSO 10% y Glicerol 10%. Posteriormente, se hicieron estudios de viabilidad microbiana respecto al tiempo de crioconservación y en función de cada una de las cuatro condiciones ensayadas, para poder elegir el tratamiento con mejores resultados. Se obtuvo como resultado que había una diferencia significativa en la viabilidad de los microorganismos (p-value<0,05) entre la muestra no tratada y las que tenían añadido un crioprotector, siendo el Glicerol al 10% el tratamiento que mejor resultado obtuvo. Una vez se eligió el tratamiento que mejor mantuvo la viabilidad a lo largo el tiempo, se volvió a preparar una solución fecal con el crioprotector y concentración elegidos y se realizó el ensayo de incubación en el Digestor in vitro de Fermentación Colónica, para establecer la reproducibilidad de los ensayos, obteniendo unos resultados prometedores.

[EN] Intestinal microbiota, in its correct homeostasis, carries out numerous functions that are essential for the individual and contributing to its metabolism. This microbiota varies enormously among individuals, and in case of imbalance different pathologies can occurred. In vitro studies of the fermentation of human feces can help to determine how different substances affect the modulation of intestinal microbiota and in recent years, studies for the transplant of feces as a treatment for different pathologies have been particularly important. In In vitro studies of colonic fermentation, the main problem today is that these studies are carried out with fresh human feces, having great variability between samples, which makes the reproducibility of the results in different assays not possible. This is why, in the present project, the main objective was to design and develop a protocol for the conservation of microorganisms that belongs to the human intestinal microbiota. To this end, a sample of previously diluted feces was prepared in thioglycolate medium, with four different conservation treatments: without any treatment, DMSO 8%, DMSO 10% and Glycerol 10%. Subsequently, microbial viability studies were made regarding to the time of cryopreservation and according to each one of the four conditions tested, in order to be able to choose the treatment with better results. Results demonstrate that there was a significant difference in the viability of the microorganisms (p-value < 0.05) between the untreated sample and those that had added a cryoprotectant, being Glycerol at 10% the treatment that best result obtained. Once the best maintained viability over time treatment was chosen, a fecal solution was re-prepared with the cryoprotectant and concentration selected and the incubation test was carried out in the in vitro Digester of Colonic Fermentation, in order to establish the reproducibility of the tests, obtaining promising results.