Desarrollo de un sistema IN-OUT, mediado por Cas9, con un marcador fluorescente para generar duplicaciones génicas en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

[ES] En la última década se ha postulado que las duplicaciones genómicas están detrás de grandes hitos evolutivos (aparición de flores, apéndices, etc), que han incrementado la complejidad y diversidad de los organismos. De hecho, se ha indicado que la levadura Saccharomyces cerevisiae desciende de un antecesor que hace 100MA sufrió una duplicación genómica, de la que solo quedan actualmente 558 pares de genes ohnólogos, y que están implicados en adaptación a estreses. Recientemente, se ha postulado que la duplicación genómica y/o génica es a la vez el mecanismo molecular que confiere robustez mutacional y el que les permite innovar y adaptarse a nuevos ambientes. Sin embargo, aún no se ha podido demostrar claramente, siendo necesario el desarrollo de un sistema que permita generar duplicaciones y observar cómo evolucionan en tiempos adecuados al observador. La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado la biotecnología en los últimos años. El sistema usa la enzima Cas9, una endonucleasa de DNA guíada por RNA (rRNA), de Streptococcus pyogenes, para realizar roturas dirigidas en el DNA del organismo diana. Este organismo diana debe reparar esas roturas, generalmente por la presencia de copias del fragmento no digeridas (en cromátidas hermanas, o proporcionadas por el investigador), lo que permite la edición precisa del genoma. Sin embargo, a día de hoy, este sistema solo permite introducir mutaciones puntuales específicas, eliminar o reemplazar genes o incluso cromosomas completos, quedando las duplicaciones génicas fuera de su campo de actuación. Es precisamente este último punto, el objetivo de este TFG, el desarrollo de un sistema para generar duplicaciones génicas en Saccharomyces cerevisiae de forma precisa, sin dejar rastro y que permita realizar el seguimiento de forma visual. El objetivo final, se engloba dentro del proyecto BFU2015-66073-P, en el que se pretende demostrar que las duplicaciones confieren robustez mutacional y a la vez son fuente de innovaciones, mediante una aproximación evolutiva-experimental, lo que requiere el uso de organismos que evolucionen rápidamente en condiciones de laboratorio. En este TFG se ha construido un plásmido para generar un cassette de expresión en levadura de una proteína fluorescente cyan como primera parte del sistema IN-OUT mediado por CRISPR/Cas9 para la generación de duplicaciones génicas en Saccharomyces cerevisiae. Concretamente, se ha generado por ¿over extension PCR¿ un constructo que pone bajo el promotor y terminador del gen tef1 (YPR080W), al gen AmCyan, de la anémona Anemonia majano, estando cada uno de estos tres fragmentos generados por PCR. Este constructo se ha clonado en el vector pUG6, aplicando la técnica ¿TA-clonning¿ en Escherichia coli DH5α. Tras el rastreo de los clones obtenidos, se han seleccionado al menos tres, que contienen el constructo, que se han usado de molde para generar por PCR el cassette que se utilizará como fragmento de recombinación en S. cerevisiae BY4741 (primera parte del sistema IN-OUT).

[EN] In the last decade, it has been postulated that genome duplications are behind evolutionary milestones (ie. rising of flowering plants, vertebrates¿ appendices, etc), increasing complexity and diversity of organisms in the globe. In fact, the model organism Saccharomyces cerevisiae descends from a predecessor that 100 MYA underwent a whole genome duplication. Nowadays, only 558 gene pairs remain as duplicates (named as ohnologs) in its genome, being most of them involved in adaptation to stresses. Recently, it has been postulated that whole genome or small-scale duplication is both the molecular mechanism that confers mutational robustness and the one that allows them to innovate and adapt to new environments. Despite this, it has not yet been possible to demonstrate clearly, requiring the development of a duplication induction system which allows the observation on how they evolve at appropriate timelines. The CRISPR/Cas9 technology has revolutionized biotechnology field in the past 2-4 years. The system uses the Cas9 enzyme, a RNA-guided DNA endonuclease, from Streptococcus pyogenes, to perform targeted breaks in the DNA. The target organism must repair these breaks to keep alive, usually by the presence of undigested copies of the genome (sister chromatids or provided by the researcher), which allows the precise edition of the target genome. To date this system only allows the introduction of specific point mutations, or the replacement or introduction of alien genes and/or even deleting whole chromosomes, leaving gene duplication outside its action field. It is precisely this last point, the development of a system Cas9-driven to generate precise, drug-resistant markerless and visual gene (along with its regulatory regions) duplications in S. cerevisisae as the objective of this FYP. This FYP is encompassed within the project BFU2015-66073-P, on which it is intended to demonstrate how duplications confer mutational robustness and are also the source of innovation, through an evolutionary experimental approach. In this FYP a plasmid has been constructed as first part of the In-Out system. This plasmid will serve as source for homology repair fragment. This first fragment will aid in the visual follow up of the system by introducing the fluorescent gene AmCyan, from the anemone Anemonia majano, under the control of tef1 promoter and terminator (YPR080W). This fragment has been obtained by over extension PCR technique from the three independent PCR fragments, and TA-cloned into pUG6 vector. Preliminary results of S. cerevisiae BY4741 strain transformation with this system are reported here.