Obtención de un RNA viral modificado para su utilización en estudios de interacción entre proteínas virales y del huésped

Abstract

[ES] El virus del mosaico de la alfalfa (AMV) infecta alfalfa y a más de 600 especies vegetales de interés agronómico como tomate, patata o pimiento. El virus se transmite a través de polen, semillas y pulgones. El genoma del virus está formado por 3 moléculas de ácido ribonucleico (RNA 1, RNA 2 y RNA 3) de cadena sencilla y de polaridad positiva. Los RNAs 1 y 2 codifican las subunidades de la replicasa viral; el RNA 3 codifica la proteína de movimiento (MP) y sirve como molde para la síntesis de un RNA subgenómico (sgRNA 4) que codifica la proteína de cubierta (CP). En este virus, la CP es una proteína multifuncional que está implicada en diversos procesos del ciclo infectivo del virus. Los virus como parásitos intracelulares necesitan alterar la función de diferentes componentes del huésped para multiplicarse. En muchos casos, los virus utilizan sus propias proteínas virales para interaccionar con factores del huésped y así subvertir su función en favor del patógeno. En el caso del AMV, la implicación de la CP en diferentes procesos del ciclo replicativo la hace una excelente candidata para identificar proteínas del huésped que interaccionen con esta proteína y participen en el ciclo viral. En este trabajo, en primer lugar, se ha abordado la construcción de un RNA 3 modificado para expresar una segunda copia de la CP del AMV fusionada al epítopo de la hemaglutinina (HA) (3xHACP). Esta proteína modificada puede ser inmunoprecipitada utilizando un anticuerpo contra el epítopo HA fusionado a resinas comerciales. Además, se han puesto a punto una serie de protocolos de inmunoprecipitación de 3xHACP, tanto de fracciones nucleares como citoplásmicas procedentes de células infectadas. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que la duplicación de la CP con la copia 3xHACP en el RNA 3 no interfiere en el proceso de replicación de este RNA viral. Este RNA 3 modificado constituye una herramienta molecular que podría utilizarse en estudios de co-inmunoprecipitación (Co-IP) para identificar factores del huésped que interaccionen con la CP.

[EN] The alfalfa mosaic virus (AMV) infects alfalfa and more than 600 plant species of agronomic interest such as tomato, potato or pepper. The virus is transmitted through pollen, seeds and aphids. The genome of the virus is formed by 3 molecules of ribonucleic acid (RNA 1, RNA 2 and RNA 3) of single chain and of positive polarity. RNAs 1 and 2 encode the subunits of the viral replicase; RNA 3 encodes the movement protein (MP) and serves as a template for the synthesis of a subgenomic RNA (sgRNA 4) that codes for the coat protein (CP). In this virus, the CP is a multifunctional protein that is involved in various processes of the infectious cycle of the virus. Viruses as intracellular parasites need to alter the function of different host components to multiply. In many cases, viruses use their own viral proteins to interact with host factors and thus subvert their function in favor of the pathogen. In the case of AMV, the involvement of the CP in different processes of the replication cycle makes it an excellent candidate to identify host proteins that interact with this protein and participate in the viral cycle. In this work, first, the construction of a modified RNA 3 to express a second copy of the CP of the AMV fused to the epitope of hemagglutinin (HA) (3xHACP) has been addressed. This modified protein may be immunoprecipitated using an antibody against the HA epitope fused to commercial resins. Subsequently, a series of 3xHACP immunoprecipitation protocols have been developed for both nuclear and cytoplasmic fractions of infected cells. The results obtained in this work show that the duplication of the CP with the 3xHACP copy in RNA 3 does not interfere in the replication process of this viral RNA. This modified RNA 3 constitutes a molecular tool that could be used in co-immunoprecipitation (Co-IP) studies to identify host factors that interact with CP.