Expresión recombinante de una RNA polimerasa bacteriana

Abstract

[ES] En cianobacterias la transcripción de genes relacionados con el metabolismo del nitrógeno está controlada por el factor de transcripción NtcA. Esta proteína perteneciente a la familia CRP de factores de transcripción interacciona con una secuencia consenso en el promotor de los genes a los que regula y es esencial para reclutar a la RNA polimerasa (RNAP) al lugar de inicio de la transcripción y activarla. El modo de interacción y el mecanismo por el cual activa a la RNAP es desconocido. Además en condiciones muy pobres de nitrógeno, NtcA es a su vez co-activada por la proteína PipX. Sabemos que dicha co-activación se debe en parte a la estabilización por parte de PipX de la forma activa del factor NtcA, pero no sabemos si PipX también interacciona con la RNAP y/o juega un papel activándola. El grupo de acogida es experto en determinación de estructuras macromoleculares mediante cristalografía de rayos X y criomicroscopía electrónica (cryoEM) y el objetivo global del grupo es estudiar mediante cryoEM la activación de la transcripción por los reguladores globales del metabolismo del nitrógeno NtcA y PipX (Llacer et al, Proc Natl Acad Sci 2010, 107:15397- 402) obteniendo para ello la estructura de estas dos proteínas unidas simultáneamente a la RNAP y al promotor de un gen. Dentro de este plan se enmarca el proyecto, cuyo objetivo principal será la clonación de los distintos genes de una RNA polimerasa (RNAP) cianobacteriana, las subunidades alfa, beta, beta´, gamma, omega y sigma (tres variantes, A, B y C) en plásmidos de expresión policistrónicos compatibles entre si para su coexpresión y purificación posterior en Escherichia coli.

[EN] NtcA is a cyanobacterial transcription factor controlling the expression of nitrogen-related genes. It belongs to the family of CRP transcription factors and interacts with a certain consensus sequence found in the promoter of the genes controlled by NtcA. This interaction of NtcA with the promoter is essential for recruiting the RNA polymerase (RNAP) at the transcription start site and to activate transcription. The interaction mode and the mechanism by which NtcA activates RNAP is unknown. Moreover, in very poor nitrogen conditions, NtcA is in turn co-activated by the PipX protein. We know that this co-activation is partly due to PipX stabilization of the active form of NtcA, but we do not know if PipX also interacts with the RNAP and/or plays a role in its activation. The host group is specialized in determination of macromolecular structures by X-ray crystallography and electron cryomicroscopy (cryoEM) and the overall aim of the group is to study the transcription activation by the global nitrogen metabolism regulators NtcA and PipX (Llacer et al, Proc Natl Acad Sci 2010, 107:15397-402) by cryoEM, obtaining for this purpose the structure of these two proteins bound simultaneously to the RNAP and to a gene promoter. The current project is part of this aim, being its main objective the cloning of the genes coding for the different cyanobacterial RNA polymerase (RNAP) subunits, alpha, beta, beta’, gamma, omega and sigma (three variants, A, B and C) in suitable polycistronic expression plasmids for co-expression in Escherichia coli and subsequent purification of the whole cyanobacterial RNAP.