Análisis de la aplicación del sistema de edición génica CRISPR/Cas9 como aproximación terapéutica en distrofia muscular de Duchenne

Abstract

[ES] La distrofia muscular de Duchenne es la enfermedad muscular hereditaria más común en la infancia y tiene su origen en el gen DMD (Xp21), el más largo descrito en el genoma humano. Este gen codifica la distrofina, una proteína esencial del músculo esquelético, ya que se encarga de proteger a las células del daño provocado a largo plazo por los movimientos de contracción muscular. De este modo, en los casos en los que se produce una pérdida funcional de distrofina, tiene lugar una lenta degradación de las células musculares que desencadena las distrofias musculares de Duchenne (DMD) y Becker (BMD). Una de las posibles estrategias para corregir esta enfermedad consiste en el exon skipping, enfocado a corregir las mutaciones que interrumpen la pauta de lectura del gen. Frente al skipping de exón único, las investigaciones más recientes se dirigen hacia un skipping multiexónico que ampliaría sensiblemente el porcentaje de mutaciones corregibles y que, además, se puede beneficiar de la tecnología de edición génica CRISPR/Cas9. La racionalidad de este procedimiento se basa en que, de forma natural, se han observado pacientes portadores de una megadeleción que se extiende entre los exones 45-55 que se ha descrito en sujetos de edad avanzada asintomáticos. No obstante, también se ha observado que pacientes portadores de dicha mutación presentan síntomas en mayor o menor medida. Existen diversas hipótesis sobre los mecanismos determinantes de la gravedad de los síntomas, entre las cuales se encuentra la localización del punto de fractura intrónico. Por ello, la determinación de un punto de fractura intrónico que genere un fenotipo asintomático permite la generación de un molde para inducir la deleción de los exones 45-55 para el tratamiento en DMD. Nuestros resultados muestran la capacidad del sistema CRISPR/Cas9 de inducir in vitro esta deleción en mioblastos con el fin restaurar la expresión de la distrofina. Sin embargo, una de las limitaciones de esta tecnología es que está sujeta a efectos fuera de la diana, off targets, por lo que su análisis resulta crucial antes de proceder a una terapia in vivo en pacientes.

[EN] Duchenne muscular dystrophy is the most common hereditary muscular disease in childhood and has its origin in the DMD gene (Xp21), the longest in the human genome. This gene encodes dystrophin, an essential skeletal muscle protein, which is responsible for protecting cells from long-term damage caused by muscle contraction movements. Thus, in cases in which functional dystrophin loss occurs, a slow degradation of the muscle cells takes place that triggers the muscular dystrophies of Duchenne (DMD) and Becker (BMD). One of the possible strategies to correct this disease is the exon skipping, which is focused on correcting the mutations that disrupt the reading frame of the gene. In contrast to the skipping of a single exon, the most recent investigations are directed towards a multiexonic skipping that will significantly increase the percentage of correctable mutations and that, in addition, can benefit from CRISPR / Cas9 gene editing technology. The rationality of this procedure is based on the fact that, in a natural way, it has been observed that a megadeletion that extends between exons 45-55 has been described in asymptomatic elderly subjects. However, it has also been observed that patients with this mutation show symptoms to a greater or lesser extent. There are several hypotheses about the determinant mechanisms of the severity of symptoms, among which is the location of the intronic fracture point. Therefore, the determination of an intronic fracture point that generates an asymptomatic phenotype allows the generation of a template to induce the deletion of exons 45-55 for treatment in DMD. Our results show the capacity of the system CRISPR/Cas9 to generate in vitro this deletion in myoblasts in order to restore the expression of dystrophin. However, one of the limitations of this technology is that it is linked to off target effects, so its analysis is crucial before proceeding with in vivo therapy in patients.