Mejora de la eficacia de un programa de crioconservacion de esperma humano para la reproducción asistida mediante el efecto de diferentes crioprotectores y protocolos de congelación

Abstract

[ES] La congelación de muestras seminales es el método utilizado para preservar la fertilidad masculina. Los crioprotectores disminuyen la formación de cristales de hielo, lo cual afecta a la viabilidad de la muestra tras la descongelación. Sin embargo, estos crioprotectores presentan efectos citotóxicos directamente relacionados con el crioprotector y con el protocolo de congelación utilizado. Existen un gran número de crioprotectores comerciales, así como de protocolos de congelación. Por lo tanto, es imprescindible optimizar estos protocolos de congelación mediante la elección del agente crioprotector y de las velocidades y etapas de enfriamiento que minimicen sus efectos citotóxicos. Los objetivos del presente trabajo son: en primer lugar, determinar los parámetros seminales más fiables para evaluar el resultado del proceso de criopreservación espermática y posteriormente utilizar dichas variables para la comparación de los dos crioprotectores (Test Yolk Buffer TYB y Sperm freezing Buffer SFB) y de los dos protocolos de congelación más utilizados (congelación lenta y congelación en vapores de nitrógeno) tanto para muestras congeladas en fresco como en capacitado. Para la evaluación de las variables seminales que permiten predecir los resultados de la congelación se utilizaron 53 muestras de semen frescos y 53 muestras capacitadas de varones normozoospérmicos. Para la comparación de los dos protocolos de congelación (lenta y en vapores de nitrógeno N2) así como de los dos agentes crioprotectores (TYB y SFB) se utilizaron un total de 29 muestras de semen normozoospérmicos procedentes del laboratorio de andrología de la Unidad de Reproducción Humana Asistida del Hospital Universitario y Politécnico la Fe de Valencia. Los análisis de regresión múltiple demostraron que la relación entre la motilidad total evaluada de forma automática y los resultados de viabilidad obtenidos a partir del HOS-test nos permiten obtener una ecuación capaz de predecir los resultados del HOS test a partir de los resultados de la motilidad total obtenida con el analizador automático de espermatozoides. La ecuación obtenida es igualmente válida para eyaculados frescos y/o capacitados. Además, la variable recuento de espermatozoides móviles (REM) que combina la concentración con la motilidad espermática permitió establecer diferencias. Los test de comparación de muestras demostraron que independientemente del crioprotector empleado, la congelación en vapores de N2 consigue resultados superiores a la congelación lenta, y que a mayor volumen de crioprotector mayor toxicidad tras la descongelación. Finalmente, el crioprotector SBF añadido v:v permite obtener resultados similares a los obtenidos con TYB tras la descongelación tanto para las variables motilidad total como para el REM. En conclusión, las variables motilidad total y REM serían las variables más fiables para la evaluación de los resultados de la congelación. El análisis automático de la motilidad total resulta más fiable, rápido y económico que la realización del HOS test. La adición del crioprotector v:v y la congelación en vapores de N2 con independencia del crioprotector utilizado permite obtener los mejores resultados tras la descongelación. El crioprotector SBF añadido v:v y la congelación en vapores permitiría optimizar los protocolos de congelación y descongelación de espermatozoides humanos.

[EN] Freezing of seminal samples is the method used to preserve male fertility. Cryoprotectants decrease the formation of ice crystals, which affects the viability of the sample after thawing. However, these cryoprotectants present cytotoxic effects directly related to the cryoprotectant and to the freezing protocol of election. There are a large number of commercial cryoprotectants, as well as freezing protocols. Therefore, it is essential to optimize these freezing protocols by choosing the cryoprotective agent and cooling speeds and stages that minimize their cytotoxic effects. The objectives of the present work are: first, to determine the most reliable semen parameters to evaluate the result of the sperm cryopreservation process and later to use those variables for the comparison of the two cryoprotectants (Test Yolk Buffer TYB and Sperm freezing Buffer SFB) and of the two most commonly used freezing protocols (slow freezing and freezing in nitrogen vapours) for both fresh and capacitated frozen samples. For the evaluation of the seminal variables that allow predicting the results of the freezing, 53 of fresh semen samples and 53 capacitated samples of normozoospermic males were used. For the comparison of the two freezing protocols (slow and in N2 nitrogen vapours) as well as the two cryoprotective agents (TYB and SFB), were used a total of 29 normozoospermic semen samples from the andrology laboratory of the Human Assisted Reproduction Unit of the Hospital Universitario y Politécnico la Fe de Valencia. The multiple regression analysis showed that the relationship between the total motility evaluated automatically and the feasibility results obtained from the HOS-test allow us to obtain an equation capable of predicting the results of the HOS test from the results of the motility total obtained with the automatic sperm analyser. The equation obtained is equally valid for fresh and / or capacitated ejaculates. In addition, the mobile sperm count (REM) variable that combines concentration with sperm motility allowed to establish differences. The sample comparison tests showed that independently of the cryoprotectant used, freezing in vapours of N2 achieves results superior to slow freezing, and that a larger volume of cryoprotectant increases toxicity after thawing. Finally, the cryoprotectant SBF added v:v allows obtaining results similar to those obtained with TYB after thawing both for the total motility variables and for REM. In conclusion, the variables total motility and REM would be the most reliable variables for the evaluation of freezing results. The automatic analysis of total motility is more reliable, faster and cheaper than the performance of the HOS test. The addition of cryoprotectant v:v and freezing in N2 vapours independently of the cryoprotectant used allows obtaining the best results after thawing. The cryoprotectant SBF added v:v and the freezing in vapours would allow to optimize the freezing and thawing protocols of human sperm.