Efecto de la vitrificación embrionaria sobre el número de mitochondrial en embriones preimplantacionales y en tejido hepático en conejo

Abstract

[ES] En la actualidad, entre un 1 y un 4% de los niños son concebidos mediante el empleo de técnicas de reproducción asistida (TRAs), siendo uno de los procedimientos más comunes la crioconservación de embriones. Esta técnica consiste en someter a los embriones a temperaturas bajo cero con el fin de detener su actividad metabólica al tiempo que se conserva su integridad. Hasta el momento, se ha considerado una herramienta biotecnológica neutra, pero trabajos previos en conejo (Oryctolgus cuniculus) y otras especies parecen indicar lo contrario. A nivel embrionario se han observado alteraciones en el metabolismo energético, así como en la fase postnatal, registrando un menor peso de hígado, menor velocidad de crecimiento o menor peso al nacer. A nivel mitocondrial se han observado diferencias en la distribución de las mitocondrias, en su potencial de membrana y en la acumulación de especies reactivas de oxígeno, lo que convierte el análisis mitocondrial en una herramienta útil para el estudio del efecto de las TRAs. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la vitrificación embrionaria temprana en conejo sobre el número de mitocondrias tanto a nivel embrionario como postnatal. Para ello, se estableció una población control y otra vitrificada, y se puso a punto la cuantificación relativa de las mitocondrias. El análisis del número mitocondrial se llevó a cabo mediante la cuantificación del gen tRNA-Leu, específico del genoma mitocondrial, normalizado por la cuantificación del gen de la histona, específico del genoma celular, obteniéndose así el número de mitocondrias en base al número de células. Además, para evaluar el efecto a nivel pre- y postnatal, se emplearon 3 grupos experimentales: embriones de 6 días (prenatal) y animales de 9 semanas y 10 meses (postnatal). Los resultados obtenidos en relación a la eficiencia de los genes seleccionados para el estudio mostraron que, tanto los primers como las condiciones de amplificación, eran adecuadas para llevar a cabo la cuantificación. Además, también se observó la evolución de las mitocondrias a lo largo de la vida del conejo. Se encontraron diferencias en el número de estas entre la etapa pre y postnatal, siendo mayor en la primera dada la energía requerida durante el desarrollo embrionario. Estas diferencias también fueron visibles entre animales juveniles y adultos. Con el fin de compensar la alteración de la actividad mitocondrial, los adultos presentaron un mayor número de estos orgánulos. Finalmente, se observaron diferencias significativas en la cantidad de mtDNA en embriones de 6 días. Los embriones del grupo vitrificado presentaban un aumento en los niveles de mtDNA si se comparaban con los del grupo control, revelando el efecto que las TRAs presentan en la cantidad de mitocondrias durante el desarrollo embrionario. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre las muestras provenientes de conejos de 9 semanas y 10 meses, lo que sugiere que este efecto disminuye con el desarrollo del individuo hasta normalizarse.

[EN] Nowadays, between 1% and 4% of children are conceived by assisted reproductive technologies (ARTs), being embryo cryopreservation one of the most common procedures. This technique is based on exposing embryos to sub-zero temperatures in order to stop their metabolic activity while preserving their integrity. Until now, it has been considered a neutral biotechnological tool, but studies on rabbits (Oryctolgus cuniculus) and other species seem to indicate the opposite. In embryos, alterations in the energy metabolism have been observed. Furthermore, lower liver weight, slower growth rate and lower birth wieight have been shown as postnatal effects. At mitochondrial level, differences have been observed in the distribution of mitochondria, in their membrane potential and in the accumulation of reactive oxygen species, making the number of mtDNA copies a useful tool to study the effect of ARTs. The objective of this work was to evaluate the effect of early embryo vitrification in rabbit on the number of mitochondria. To this end, 2 populations were developed, naturally conceived animals and vitrified embryos transferred to surrogate mothers. In addition, the relative quantification of the mitochondria was set up. The mitochondrial analysis was carried out by the quantification of tRNA-Leu, specific to the mitochondrial genome, normalized by the quantification of histone, specific to the cellular genome, obtaining the number of mitochondria based on the number of cells. Moreover, in order to evaluate both pre and postnatal effect, 3 experimental groups were also developed, which included 6 dayold embryos and animals between 9 weeks and 10 months of age. The results obtained in relation to the efficiency of the genes selected for the study showed that both the primers and the amplification conditions were suitable to carry out the quantification. In addition, the mitochondria evolution throughout the rabbit’s life was also observed. Differences in their number were found between pre and postnatal stage, being higher during the prenatal stage due to the energy required during the embryo development. These differences were also visible between juvenile and adult animals. In order to counteract the altered mitochondrial activity, adults had a greater number of these organelles. Finally, significant differences in the mtDNA quantity in 6 day-old embryos. Vitrified and transferred embryos had an increase in mtDNA levels when compared to naturally conceived embryos. These results revealed some of the effects that ARTs have in the number of mitochondria during embryonic development. However, no significant differences were found in the number of mtDNA copies in rabbits between 9 weeks and 10 months of age, suggesting that this effect decreases during the individual development until it normalizes.