Resumen:
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[ES] En la actualidad, entre un 1 y un 4% de los niños son concebidos mediante el
empleo de técnicas de reproducción asistida (TRAs), siendo uno de los procedimientos más
comunes la crioconservación de embriones. Esta ...[+]
[ES] En la actualidad, entre un 1 y un 4% de los niños son concebidos mediante el
empleo de técnicas de reproducción asistida (TRAs), siendo uno de los procedimientos más
comunes la crioconservación de embriones. Esta técnica consiste en someter a los embriones
a temperaturas bajo cero con el fin de detener su actividad metabólica al tiempo que se
conserva su integridad. Hasta el momento, se ha considerado una herramienta
biotecnológica neutra, pero trabajos previos en conejo (Oryctolgus cuniculus) y otras
especies parecen indicar lo contrario. A nivel embrionario se han observado alteraciones en
el metabolismo energético, así como en la fase postnatal, registrando un menor peso de
hígado, menor velocidad de crecimiento o menor peso al nacer. A nivel mitocondrial se han
observado diferencias en la distribución de las mitocondrias, en su potencial de membrana y
en la acumulación de especies reactivas de oxígeno, lo que convierte el análisis mitocondrial
en una herramienta útil para el estudio del efecto de las TRAs.
El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la vitrificación embrionaria temprana en
conejo sobre el número de mitocondrias tanto a nivel embrionario como postnatal. Para ello,
se estableció una población control y otra vitrificada, y se puso a punto la cuantificación
relativa de las mitocondrias. El análisis del número mitocondrial se llevó a cabo mediante la
cuantificación del gen tRNA-Leu, específico del genoma mitocondrial, normalizado por la
cuantificación del gen de la histona, específico del genoma celular, obteniéndose así el
número de mitocondrias en base al número de células. Además, para evaluar el efecto a nivel
pre- y postnatal, se emplearon 3 grupos experimentales: embriones de 6 días (prenatal) y
animales de 9 semanas y 10 meses (postnatal).
Los resultados obtenidos en relación a la eficiencia de los genes seleccionados para el estudio
mostraron que, tanto los primers como las condiciones de amplificación, eran adecuadas
para llevar a cabo la cuantificación. Además, también se observó la evolución de las
mitocondrias a lo largo de la vida del conejo. Se encontraron diferencias en el número de
estas entre la etapa pre y postnatal, siendo mayor en la primera dada la energía requerida
durante el desarrollo embrionario. Estas diferencias también fueron visibles entre animales
juveniles y adultos. Con el fin de compensar la alteración de la actividad mitocondrial, los
adultos presentaron un mayor número de estos orgánulos. Finalmente, se observaron
diferencias significativas en la cantidad de mtDNA en embriones de 6 días. Los embriones del
grupo vitrificado presentaban un aumento en los niveles de mtDNA si se comparaban con los
del grupo control, revelando el efecto que las TRAs presentan en la cantidad de mitocondrias
durante el desarrollo embrionario. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas
entre las muestras provenientes de conejos de 9 semanas y 10 meses, lo que sugiere que
este efecto disminuye con el desarrollo del individuo hasta normalizarse.
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[EN] Nowadays, between 1% and 4% of children are conceived by assisted reproductive
technologies (ARTs), being embryo cryopreservation one of the most common procedures.
This technique is based on exposing embryos to ...[+]
[EN] Nowadays, between 1% and 4% of children are conceived by assisted reproductive
technologies (ARTs), being embryo cryopreservation one of the most common procedures.
This technique is based on exposing embryos to sub-zero temperatures in order to stop their
metabolic activity while preserving their integrity. Until now, it has been considered a
neutral biotechnological tool, but studies on rabbits (Oryctolgus cuniculus) and other species
seem to indicate the opposite. In embryos, alterations in the energy metabolism have been
observed. Furthermore, lower liver weight, slower growth rate and lower birth wieight have
been shown as postnatal effects. At mitochondrial level, differences have been observed in
the distribution of mitochondria, in their membrane potential and in the accumulation of
reactive oxygen species, making the number of mtDNA copies a useful tool to study the
effect of ARTs.
The objective of this work was to evaluate the effect of early embryo vitrification in rabbit
on the number of mitochondria. To this end, 2 populations were developed, naturally
conceived animals and vitrified embryos transferred to surrogate mothers. In addition, the
relative quantification of the mitochondria was set up. The mitochondrial analysis was
carried out by the quantification of tRNA-Leu, specific to the mitochondrial genome,
normalized by the quantification of histone, specific to the cellular genome, obtaining the
number of mitochondria based on the number of cells. Moreover, in order to evaluate both
pre and postnatal effect, 3 experimental groups were also developed, which included 6 dayold embryos and animals between 9 weeks and 10 months of age.
The results obtained in relation to the efficiency of the genes selected for the study showed
that both the primers and the amplification conditions were suitable to carry out the
quantification. In addition, the mitochondria evolution throughout the rabbit’s life was also
observed. Differences in their number were found between pre and postnatal stage, being
higher during the prenatal stage due to the energy required during the embryo
development. These differences were also visible between juvenile and adult animals. In
order to counteract the altered mitochondrial activity, adults had a greater number of these
organelles. Finally, significant differences in the mtDNA quantity in 6 day-old embryos.
Vitrified and transferred embryos had an increase in mtDNA levels when compared to
naturally conceived embryos. These results revealed some of the effects that ARTs have in
the number of mitochondria during embryonic development. However, no significant
differences were found in the number of mtDNA copies in rabbits between 9 weeks and 10
months of age, suggesting that this effect decreases during the individual development until
it normalizes.
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