Estudio del papel del oncogén MYCN como factor de transcripción en la regulación del promotor del gen IDH2

Abstract

[ES] El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más habitual en niños, formándose en las células primordiales de la cresta neural. La mayoría de los neuroblastomas son formas esporádicas y sólo en el 1-2 % de los pacientes se trata de una enfermedad hereditaria. Mientras algunos casos de bajo riesgo desarrollan una regresión espontánea, incluso sin ningún tipo de tratamiento, más de la mitad de los pacientes de alto riesgo son pobres respondedores a la terapia multimodal empleada. La amplificación del oncogén MYCN es considerado un factor de alto riesgo en neuroblastoma, independientemente de otros factores genéticos y clínicos como la edad, confiriendo a los pacientes un mal pronóstico con desarrollo rápido y fatal de la enfermedad. La amplificación de MYCN da lugar a su sobreexpresión y consecuentemente a la ganancia de su función. Parte de la actividad oncogénica de MYCN en neuroblastomas puede deberse a la formación del complejo activo con MAX, el cual promueve la sobreexpresión y sobreactivación de diversos genes diana, entre los que podría encontrarse el gen IDH2. A su vez, la ganancia en la actividad enzimática de IDH2 produce la acumulación del oncometabolito 2-HG. Un exceso de 2-HG puede verse asociado al aumento de angiogénesis y a una mayor metilación de histonas y ADN, lo que se traduce en una alteración de la diferenciación de las células cancerosas. Por lo tanto, el bloqueo de la actividad de IDH2 en neuroblastomas con MYCN amplificado puede dar lugar a una terapia más efectiva y dirigida en este tipo de neuroblastomas de alto riesgo.

En este proyecto se estudia el papel del oncogén MYCN como factor de transcripción en la regulación del promotor del gen IDH2. Nuestra hipótesis de trabajo es que la mutación de las potenciales cajas E del promotor de IDH2 impedirá la transcripción de IDH2 mediada por MYCN. Para demostrarlo, primero se identificaron los posibles sitios de respuesta a MYCN en el promotor de IDH2. Utilizando la técnica de mutagénesis dirigida, se crearon mutaciones en los elementos de respuesta. A continuación, se generaron bacterias E.coli DH5¿ supercompetentes y seguidamente, se transformaron y se crecieron en placas Petri con antibiótico, con el fin de seleccionar las colonias que habían incorporado los vectores de clonación con la secuencia mutada. Finalmente, se transfectaron los distintos promotores de IDH2, silvestre y mutantes, en una línea celular de neuroblastoma para comparar sus actividades mediante ensayos de luciferasa.

Nuestros resultados demostraron que el oncogén MYCN regula transcripcionalmente el promotor de IDH2. Concretamente, nuestros análisis muestran que los elementos de respuesta E1 y E3 del promotor de IDH2 son mejores mediadores de la activación transcripcional por MYCN que E2. Además, cabe resaltar que ninguno de los tres elementos de respuesta por sí solo es indispensable para que MYCN active transcripcionalmente el promotor de IDH2, sugiriendo el efecto compensatorio entre ellos o, alternativamente, una activación transcripcional indirecta del promotor de IDH2 por MYCN.

[EN] Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumor in childhood. It arises from the primordial cells of the neural crest. Neuroblastoma is in most of the cases a sporadic disease. However, neuroblastoma is a germinal disease in 1-2% of patients. While some low-risk cases experience spontaneous regression, even without any treatment, more than half of the high-risk cases are poor responders to the multimodal therapy employed. MYCN amplification is by itself a high-risk factor, regardless of other genetic and clinical factors such as age, giving these patients a poor prognosis with rapid and fatal development of the disease. Therefore, it¿s essential to understand how MYCN amplification transforms normal cells into cancer cells highly aggressive and resistant to the treatment. MYCN amplification results in its overexpression and consequently the gain of its function. Some of MYCN¿s oncogenic activity in neuroblastomas may be due to the formation of the active complex with MAX, which promotes overexpression and overactivation of various target genes, including the IDH2 gene. In turn, the gain in enzymatic activity of IDH2 results in the accumulation of oncometabolite 2HG. An excess of 2-HG may be associated with increased angiogenesis and increased methylation of histones and DNA, resulting in an alteration of the differentiation of cancer cells. Therefore, blocking the activity of IDH2 in amplified MYCN neuroblastomas may result in more effective and targeted therapy in this type of high-risk neuroblastoma.

This project studies the role of the MYCN oncogene as a transcription factor in the regulation of the promoter of the IDH2 gene. Our working hypothesis is that mutation of E boxes within IDH2 promoter will prevent the MYCN-mediated IDH2 transcription, hence, demonstrating MYCN direct transcriptional action on IDH2. To prove this, potential MYCN response sites were first identified in the IDH2 promoter. Using the site-directed mutagenesis technique, mutations were created in the response elements. Subsequently, supercompetent E.coli DH5¿ bacteria were generated and then transformed and grown into Petri plaques with antibiotic, in order to select colonies that had incorporated cloning vectors with the mutated sequence. Finally, the different promoters of wild type and mutant IDH2 were transfected into a cell line of neuroblastoma to compare their activities with luciferase assays.

Our results showed that the MYCN oncogene regulates transcriptionally the IDH2 promoter. Specifically, our analyses show that the E1 and E3 response elements of the IDH2 promoter are better mediators of transcriptional activation by MYCN than E2. Furthermore, it should be noted that none of the three response elements alone is indispensable for MYCN to transcriptionally activate the promoter of IDH2, suggesting the compensatory effect between them or, alternatively, an indirect transcriptional activation of the IDH2 promoter by MYCN.