Bases moleculares del déficit de N-acetilglutamato sintasa: impacto de mutaciones clínicas en la estabilidad y actividad enzimática del enzima humano producido recombinantemente

Abstract

[ES] La N-acetil-L-glutamato sintasa (NAGS) es un enzima mitocondrial que cataliza la acetilación de L-glutamato utilizando acetil coenzima A, produciendo N-acetil-L-glutamato (NAG), activador esencial del primer enzima del ciclo de la urea, la carbamoil fosfato sintetasa I. El ciclo de la urea es la ruta metabólica que convierte el amonio producido en el catabolismo proteico en urea. Mientras que el amonio es una sustancia tóxica la urea es una molécula inocua que se excreta en la orina. El déficit de N-acetil-L-glutamato sintasa (NAGSD; OMIM #237310) es causado por mutaciones en el gen NAGS (17q21.31). Es el desorden más raro del ciclo de la urea, siendo indistinguible clínicamente del déficit de carbamoil fosfato sintetasa I (CPSID). Existen formas muy severas de NAGSD, que se presentan en el periodo neonatal temprano, y formas menos severas de aparición más tardía. Los síntomas incluyen vómitos recurrentes, alteraciones neurológicas como letargia y convulsiones, con progresión a coma e incluso a la muerte. Puesto que NAGSD y CPSID son clínicamente indistinguibles, su diagnóstico diferencial se basa en la práctica hoy en la identificación de mutaciones en el gen correspondiente. Este diagnóstico diferencial es clave, ya que solo la NAGSD tiene tratamiento sustitutivo eficaz, la administración de N-carbamil-L-glutamato (NCG; denominación farmacéutica, ácido carglúmico), un medicamento huérfano análogo del NAG que es absorbible por vía oral y es resistente a las deacilasas tisulares, y que activa a la CPSI, reemplazando al acetilglutamato. Para establecer correlaciones genotipo-fenotipo es clave producir NAGS de manera recombinante introduciendo a voluntad las mutaciones identificadas en pacientes y estudiar experimentalmente los efectos de estas mutaciones sobre la estabilidad y la funcionalidad de la NAGS. Al no disponer de un sistema que permitiera la producción recombinante y purificación de NAGS humana, enzima muy inestable, el laboratorio del Dr. Rubio usó como modelo una NAGS bacteriana, de Pseudomona aeruginosa, en la que introdujo algunas de las mutaciones clínicas descritas y estudió sus efectos sobre la estabilidad y actividad enzimática. No obstante, este sistema posee limitaciones a la hora del estudio del enzima y su déficit. Tras mucho esfuerzo, el laboratorio del Dr. Rubio ha conseguido estabilizar la NAGS humana introduciéndole en su extremo amino terminal la proteína de unión a maltosa (MBP). En este trabajo se produce esa proteína de fusión, que también lleva una etiqueta de poli histidinas en el extremo N-terminal, expresando el gen quimérico en Escherichia Coli Rosetta pLysS, y purificando la proteína en abundancia mediante un paso de cromatografía de afinidad. La posterior digestión con una proteasa muy específica escinde la etiqueta His6 -MPB de la NAGS humana. De este modo hemos expresado y purificado la forma silvestre de NAGS humana y 6 mutantes clínicos: 5 del dominio regulador (M167V, P260L, T264M, A279T, L312P) y 1 del dominio catalítico (S410P). Se ha estudiado la solubilidad y determinado la actividad enzimática, los parámetros cinéticos y la estabilidad térmica de estas formas de NAGS humana.

[EN] N-acetyl-L-glutamate synthase (NAGS) is a mitochondrial enzyme that catalyzes the acetylation of L-glutamate using acetyl coenzyme A, producing N-acetyl-L-glutamate (NAG), an essential activator of the first enzyme in the cycle of the urea, carbamoyl phosphate synthetase I. The urea cycle is the metabolic pathway that converts the ammonium produced in protein catabolism into urea. While ammonium is a toxic substance, urea is a harmless molecule that is excreted in the urine. The N-acetyl-L-glutamate synthase deficiency (NAGSD; OMIM # 237310) is caused by mutations in the NAGS gene (17q21.31). It is the rarest disorder of the urea cycle, being clinically indistinguishable from carbamoyl phosphate synthetase I (CPSID) deficiency. There are very severe forms of NAGSD, which occur in the early neonatal period, and less severe forms of later onset. Symptoms include recurrent vomiting, neurological disorders such as lethargy and seizures, with progression to coma and even death. Since NAGSD and CPSID are clinically indistinguishable, their differential diagnosis is based on practice today in the identification of mutations in the corresponding gene. This differential diagnosis is key, since only NAGSD has effective replacement therapy, the administration of N-carbamil-L-glutamate (NCG; pharmaceutical name, carglumic acid), an orphaned NAG analogue drug that is orally absorbable and is resistant to tissue deacylases, and that activates CPSI, replacing acetylglutamate. To establish genotype-phenotype correlations, it is essential to produce NAGS recombinantly by introducing the mutations identified in patients at will and to study experimentally the effects of these mutations on the stability and functionality of NAGS. Not having a system that allowed the recombinant production and purification of human NAGS, a very unstable enzyme, Dr. Rubio's laboratory used as a model a bacterial NAGS, of Pseudomona aeruginosa, in which he introduced some of the clinical mutations described and studied its effects on stability and enzymatic activity. However, this system has limitations when studying the enzyme and its deficit. After much effort, Dr. Rubio's laboratory has managed to stabilize human NAGS by introducing the maltose binding protein (MBP) at its amino terminal end. In this work, this fusion protein is produced, which also carries a poly histidine tag at the N-terminal end, expressing the chimeric gene in Escherichia coli Rosetta pLysS, and purifying the protein in abundance by means of an affinity chromatography step. Subsequent digestion gives a very specific protease cleaves the His6 -MPB tag from human NAGS. In this way we have expressed and purified the wild form of human NAGS and 6 clinical mutants: 5 in the regulatory domain (M167V, P260L, T264M, A279T, and L312P) and 1 in the catalytic domain (S410P). The solubility, the enzymatic activity, kinetic parameters and the thermal stability of these forms of human NAGS have been studied.