Análisis de mecanismos de acción del supresor del silenciamiento por RNA codificado por el virus del arrugamiento del nabo (Turnip crinkle virus, TCV)

Abstract

[ES] El silenciamiento génico mediado por RNA es un sistema general de regulación de la expresión génica específico de secuencia que está conservado en eucariotas. Desde un punto de vista mecanístico, el proceso de silenciamiento se desencadena a partir de RNAs de doble cadena (double stranded RNAs, dsRNAs) o de RNAs de simple cadena (single stranded, RNAs, sRNAs) con una elevada estructura secundaria. Estas moléculas son reconocidas y procesadas por RNasas de tipo III de tipo Dicer (Dicer-like, DCL) generando pequeños RNAs (small RNAs, sRNAs) de doble cadena con un tamaño de 21 a 24 nt. Posteriormente, una helicasa separa estos dúplex de RNA y una hebra es incorporada a un complejo efector conocido como RISC (RNA-induced silencing complex), cuyo componente activo es una proteína de la familia de las endonucleasas denominadas Argonautas (Argonautes, AGO). El sRNA cargado guiará a RISC hasta un mRNA de secuencia complementaria induciendo su degradación o la represión de su traducción.

En plantas, el silenciamiento por RNA constituye un potente mecanismo de defensa antiviral. Los virus, en alguna etapa de su replicación, generan moléculas de dsRNA que pueden actuar como inductores del silenciamiento. Esta activación del silenciamiento les convierte en diana de este mecanismo, dando lugar a la fragmentación de su genoma y a la formación de sRNAs de origen viral (virus derived small RNAs, vsRNAs) Para contrarrestar este mecanismo, los virus codifican proteínas conocidas como supresores del silenciamiento por RNA (viral RNA silencing suppressors, VSR). Los VSR son muy diversos en cuanto a tamaño y secuencia, y las bases moleculares de su actividad no se conocen con precisión en muchos casos. Distintos trabajos han puesto de manifiesto que los VSR pueden interferir en cualquier punto de la ruta de silenciamiento y que un mismo VSR puede tener una o varias dianas dentro de dicha ruta. Uno de los VSR más estudiados hasta el momento corresponde a la proteína p38 codificada por el virus del arrugamiento del nabo (Turnip crinkle virus, TCV). Esta proteína, además de actuar como VSR, es la proteína de cubierta del virus, una bifuncionalidad que dificulta el análisis de relaciones estructura-función en la molécula. A pesar de los numerosos trabajos existentes sobre p38, las bases moleculares de su actividad como VSR y las posibles consecuencias de esta actividad para la planta hospedadora no han sido bien establecidas. Resultados recientes indican que este VSR ejerce su función fundamentalmente a través de la unión de dsRNAs largos y de sRNAs interfiriendo, por una parte, con la acción de DCL y, por otra, impidiendo que los sRNAs se carguen en RISC. En este trabajo, se seguirá analizando el modo de acción de p38 y, particularmente, se explorará si esta proteína es capaz de interferir con la ruta de silenciamiento mediada por microRNAs (miRNAs), unos sRNAs endógenos de la planta que median la regulación de numerosos procesos de desarrollo. La confirmación de este supuesto extendería resultados obtenidos hasta el momento solo con un VSR codificado por un virus de cítricos y podría aportar nuevos datos acerca de los mecanismos de patogénesis viral.

[EN] In plants, RNA silencing constitutes a potent antiviral defense mechanism. This mechanism is activated by double-stranded viral RNAs (dsRNAs) that are recognized by RNases III of Dicer type (DCL), whose action generates small RNAs (sRNAs). Next, one of the strands of these sRNAs is incorporated into a multiproteic complex (RISC), whose main component is an endonuclease of the Argonaute family (AGO). Once activated, RISC is directed by the associated sRNA to cognate RNA promoting its degradation. In order to evade this defense mechanism, viruses encode proteins known as RNA suppression suppressors (VSR). VSRs interfere with virtually all stages of the silencing pathway, either acting on RNA molecules or with protein components of that pathway. In addition, it has been proposed that the presence of VSR during viral infection could influence the appearance of symptoms if the VSR is able to sequester endogenous sRNAs from the plant and, particularly, microRNA (miRNA), regulators of gene expression involved in development processes. Recently, it has also been proposed that VSRs could interfere with the pathway of miRNA biogenesis by interacting with miRNA precursors and/or with protein path factors. In this work, we have explored whether the latter is the case of the p38 protein of the Turnip crinkle virus (TCV), a VSR capable of binding short and long dsRNAs. Through the expression of fusions of p38 with fluorescent proteins in Nicotiana benthamiana cells, it has been possible to verify that p38 is located in the cytoplasm and nucleus. As miRNA maturation in plants takes place in the latter cell compartment, it has been examined whether p38 co-locates with the main proteins miRNA biogenesis (DCL1, HYL1 or SE) with apparently negative results. To directly determine whether p38 was able to interact with these proteins, bimolecular fluorescence complementation assays have been carried out that have indicated that p38 does not interact with the most relevant factors of the miRNA biogenesis pathway. It has also been analyzed if p38 co-locates and/or interacts with AGO1, involved in antiviral response and also an effector molecule of miRNA activity, obtaining positive results in both cases. Although p38 does not appear to interact with the most relevant proteins of the miRNA maturation pathway, it could be directly associated with the precursors of miRNAs, which would influence the accumulation of mature miRNA. To see if such accumulation is affected in N. benthamiana plants infected with TCV, experiments have been initiated to compare miRNA levels in virus-infected versus uninfected plants. Small RNAs extracted from these plants have undergone hybridization for the detection of a selected set of miRNA, although the signals obtained have been too weak to be quantified. Hybridization conditions will be modified in experiments that will be performed soon to try to improve the detection of miRNA and proceed to their relative quantification.