Clasificación funcional de variantes intrónicas profundas en pacientes con Leucemia Mieloblástica Aguda

Abstract

[ES] La Leucemia Mieloide Aguda (LMA) es un tipo de neoplasia hematológica que se caracteriza por la proliferación descontrolada de precursores mieloides indiferenciados. Resulta en un defecto de la hematopoyesis normal y un descenso en el número de eritrocitos, plaquetas y linfocitos normales en la sangre. La incidencia de la enfermedad está estrechamente ligada a la edad, llegando a 12,2/100.000 casos para individuos mayores de 65 años. La LMA destaca por su alta variabilidad citogenética y molecular, que ha fundamentado la creación de esquemas de clasificación de LMA en función del riesgo y subtipo molecular. Con el desarrollo de las tecnologías de secuenciación, han surgido nuevas iniciativas como el proyecto ¿The Cancer Genome Atlas (TCGA)¿, dedicados a la caracterización molecular exhaustiva a nivel ¿ómico de cientos de tumores. Múltiples estudios dentro de este proyecto han tratado de establecer nuevos grupos de clasificación molecular y pronostica en base a eventos mutacionales de concurrencia y exclusividad mutua. Dentro de los casos analizados, para un grupo de pacientes (casi un 4%) no se ha conseguido asociar ninguna mutación driver de la enfermedad. El splicing es un proceso celular complejo que precisa una correcta distinción de los exones e intrones mediante el reconocimiento de elementos específicos tal como los sitios de splicing (SS) y los reguladores (SRE). Algunas variantes genéticas descritas, incluidas las que se localizan dentro de los intrones, pueden alterar este proceso como consecuencia, entre otros, de la activación/creación de un SS, dando lugar a un transcrito aberrante que incluye una región intronica inesperada, llamada ¿pseudoexón¿ (PE). Las mutaciones intrónicas profundas son variantes raras que no han sido exploradas hasta la fecha en la LMA, a pesar del papel que podrían jugar en su desarrollo y pronóstico, ya que podrían estar involucradas en los casos en los que no se ha identificado ninguna mutación conductura de la enfermedad. Evaluación del poder predictivo de SpliceAI, regSNP y SPiP: En el presente estudio se ha evaluado la precisión de tres predictores bioinformáticos de nueva generación diseñados para la predicción del efecto en el splicing de variantes de sustitución de un solo nucleótido (SpliceAI, regSNP-intron y Splicing Prediction Pipeline (SPiP)). Para ello se han probado sobre un set de 111 variantes intrónicas responsables de enfermedades mendelianas validadas en publicaciones anteriores. Análisis molecular exhaustivo de la LMA: Se ha analizado in silico (con los predictores de nueva generación) el efecto en el splicing de 522 variantes intrónicas detectadas en pacientes con LMA a partir de la cohorte de pacientes del proyecto internacional TCGA. Se disponía del análisis in silico sobre esta cohorte con predictores tradicionales (HSF, MaxEnt) y ex vivo sobre el RNA obtenidos en estudios previos. En adición, se ha analizado in vitro mediante minigenes el efecto en el splicing de 3 de las variantes (MKL2 c.155-23426G>T, MAP3K3 c.126+1975G>T, ZNF783 c.802+3652C>A) que según los análisis previos podrían causar la inclusión de un PE en el mRNA.

[EN] Acute Myeloid Leukemya (AML) is a type of hematologic malignancy characterized by the uncontrolled proliferation of undifferentiated myeloid precursors. It results in a defect in normal hematopoiesis and a decrease of normal red blood cells, platelets, and lymphocytes in blood. The indicence of the disease is linked to age, reaching 12.2/100,000 cases among individuals past the age of 65. AML stands out for its high cytogenetic and molecular variability, which has become the foundation for AML classification schemes based on risk and molecular subtype. With the development of sequencing technologies, new initiatives have emerged such as the "The Atlas of the Cancer Genome (TCGA)" project, which aimed to achieve the exhaustive molecular characterization of hundreds of tumors at -omic level. Multiple studies within this project have attempted to establish new molecular and pronostic classification groups based on mutational events of concurrence and mutual exclusivity. Among the analyzed cases, for a group of patients (¿ 4%) it was not possible to identify any driver mutation. Splicing is a complex cellular process that requires a correct distinction between exons and introns by the recognition of splice sites (SS) and regulatory elements (SRE). Some described genetic variants, including those located within introns, can alter this process as a consequence, among others, of the activation / creation of a SS, giving rise to an aberrant transcript that includes an unexpected intronic region, called ¿pseudoexon¿ (PE). Deep intronic mutations are rare variants that, to date, have not been explored in AML, despite the role they may have in its development and prognosis, as they may be involved in cases in which the cause of the desease is not yet identified. Assessment of the predictive power of SpliceAI, regSNP and SPiP: In the following dissertation, the accuracy of three new generation bioinformatic predictors designed for the prediction of the effect on splicing of single nucleotide substitution variants (SpliceAI, regSNP-intron and Splicing Prediction Pipeline (SPiP)) have been evaluated. To this end, these tools were tested against a set of 111 intronic variants responsible of Mendelian disorders which have been validated in previous publications. Comprehensive AML molecular analysis: The splicing effect of 522 intronic variants detected in patients with AML from the international TCGA project was analyzed in silico (by using the new generation predictors). In silico analyses on this cohort with traditional predictors (HSF, MaxEnt) was available, together with RNA analyses, obtained from previous dissertations. In addition, the effect on splicing of 3 of the variants (MKL2 c.155-23426G> T, MAP3K3 c.126 + 1975G> T, ZNF783 c.802 + 3652C> A), which according to previous analyses could origin PE inclusion in the mRNA, has been tested in vitro using minigenes.