Optimización de una técnica de PCR a tiempo real para la detección de Legionella spp. y especies non-pneumophilas viables

Abstract

[ES] Legionella spp. es un género de bacterias gram negativas presente en diferentes tipos de aguas, cuya reproducción y propagación en los sistemas de distribución se considera un problema de salud pública. La especie patógena más abundante es Legionella pneumophila aunque existen otras especies patógenas menos estudiadas como L. micdadei o L. anisa. La detección Legionella spp. mediante técnicas microbiológicas tradicionales es ardua y no es determinante puesto que suelen presentarse en numerosas ocasiones formas viables no cultivables. Este trabajo tiene como objetivo la puesta a punto de un protocolo de PCR cuantitativa múltiple a tiempo real (qPCRm) para la identificación y cuantificación de Legionella spp. y las dos especies patógenas L. micdadei y L. anisa. Además, mediante la incorporación de un tratamiento previo con Propidio de Monoacida (PMA) al protocolo, este método ha permitido la detección de únicamente las formas viables de las mismas. Los análisis se realizaron con SYBR Green en el caso de la detección de Legionella spp. y con dos sondas de hidrólisis TaqMan para la cuantificación de L. anisa y L. micdadei específicas de la región intergénica 23S-5S. En este trabajo, se ha conseguido optimizar un método PMA-qPCR múltiple, que podría ser aplicado para la detección de las células viables de las especies L. micdadei y L. anisa en muestras de aguas.

[EN] Legionella spp. it is a genus of gram-negative bacteria present in different types of water, whose reproduction and spread in distribution systems is considered a public health problem. The most abundant pathogenic species is Legionella pneumophila although there are other less studied pathogenic species such as L. micdadei or L. anisa. Legionella spp detection. Traditional microbiological techniques are arduous and not decisive as viable non-arable forms often occur on numerous occasions. This work aims to tune a real-time multiple quantitative PCR (qPCRm) protocol for the identification and quantification of Legionella spp. and the two pathogenic species L. micdadei and L. anisa. In addition, by incorporating prior treatment with Monoacidal Propide (PMA) into the protocol, this method has enabled the detection of only viable forms. The tests were performed with SYBR Green in the case of Legionella spp detection and with two TaqMan hydrolysis probes for the quantification of L. anisa and L. micdadei specific to the 23S-5S intergenic region. In this work, it has been possible to optimize a multiple PMA-qPCR method, which could be applied for the detection of viable cells of the species L. micdadei and L. anisa in water samples.