Contribució dels residus flanquejants carregats a la inserció d’hèlixs transmembrana en cèl·lules de mamífer

Abstract

[ES] Les proteïnes de membrana representen aproximadament un quart del proteoma humà, i estan implicades en un ampli ventall de funcions en la cèl·lula. Tot i representar una quarta part del proteoma, més de la meitat dels fàrmacs utilitzats clínicament estan dirigits a aquest tipus de proteïnes. És per això que la inserció i el plegament adequats d¿aquestes proteïnes en la membrana diana són d¿importància cabdal perquè puguen dur a terme les seues funcions biològiques. En les cèl·lules eucariotes, la majoria d¿aquestes proteïnes s¿insereixen en la membrana del reticle endoplasmàtic mitjançant un mecanisme cotraduccional mediat pel translocó Sec61. No obstant això, la biosíntesi de les proteïnes de membrana no sols requerix la inserció dels segments transmembrana, sinó també que aquests adopten l¿orientació correcta, i es pensa que el translocó exercix un paper fonamental en aquest procés. El principal determinant topològic per a la correcta orientació de les proteïnes de membrana és la presència de residus carregats positivament en la part citoplasmàtica, el que s¿anomena positive-inside rule. A més, recentment s¿ha proposat una negative-outside enrichment rule, per la qual la presència d¿aminoàcids carregats negativament en la part no citoplasmàtica de la membrana podria contribuir a la determinació de la topologia. En conseqüència, l¿objectiu d¿aquest Treball de Fi de Grau és avaluar l¿efecte que té la presència de residus carregats als extrems de les hèlixs transmembrana en la inserció d¿aquestes en les membranes biològiques in vivo, fent ús de la peptidasa líder d¿E. coli com a proteïna model en un sistema d¿expressió basat en cèl·lules HEK293T.

[EN] Membrane proteins represent approximately one quarter of the human proteome and are involved in a wide array of cellular processes. However, despite accounting for a quarter of the human proteome, more than half of the clinically used drugs target this type of proteins. In order to accomplish their biological functions, proper protein insertion and folding into the target membrane are of vital importance. In eukaryotic cells, most membrane proteins are inserted into the endoplasmic reticulum membrane through a co-translational pathway mediated by the Sec61 translocon. Nevertheless, membrane protein biosynthesis requires not only the proper insertion of transmembrane segments, but also their correct orientation within the membrane, and the translocon is believed to play a key role in this process too. The primary topological determinant that governs membrane protein orientation is the presence of positively charged residues in the cytoplasmic end of such segments, which is referred to as the "positive-inside rule". In addition, a ¿negative-outside enrichment rule¿ has recently been proposed, which posits that negatively charged amino acids are more prevalently found in the non-cytoplasmic side of the membrane and could function as topological determinants. Hence, the aim of the present work is to evaluate the effect of the presence of charged residues flanking transmembrane helices on their insertion into biological membranes in vivo, using E. coli leader peptidase as a model protein in an expression system based on HEK293T cells.