Diagnóstico molecular de pacientes con distrofias hereditarias de la retina mediante secuenciación de un panel de genes y del exoma completo

Abstract

[ES] Las distrofias hereditarias de la retina (DHR) son un conjunto de trastornos que se caracteriza por la muerte progresiva de los fotorreceptores, lo que conlleva una pérdida de la función visual, pudiendo llegar a la ceguera legal. Se estima que afectan a alrededor de 1 de cada 3.000 individuos, por lo que, las DHR se engloban dentro de las enfermedades raras. El diagnóstico genético de las DHR es fundamental para la confirmación de la sospecha clínica, ofrecer un correcto asesoramiento genético y poder incluir a los pacientes en ensayos clínicos basados en terapias dirigidas a genotipos concretos.

En este trabajo, hemos establecido el diagnóstico genético de una cohorte de pacientes con una sospecha clínica de DHR mediante secuenciación masiva dirigida. El panel de genes consta de la región codificante de 114 genes, sus regiones intrónicas flanqueantes y de varias regiones intrónicas profundas en las que previamente se han descrito mutaciones. Mediante esta estrategia se ha logrado el diagnóstico genético del 55% de los pacientes incluidos en la cohorte en consonancia con las ratios diagnósticas reportadas previamente en la bibliografía. Por otra parte, en los probandos P2 y P4 se detectó variantes patogénicas o potencialmente patogénicas en más de un gen. El hallazgo de mutaciones deletéreas en múltiples genes puede impactar significativamente sobre las elecciones reproductivas de los pacientes y sobre su elegibilidad para recibir un tratamiento genético específico para un gen.

En los pacientes cuyo diagnóstico estaba completo, las mutaciones causantes de la patología se distribuían a lo largo de 8 genes distintos: 3 genes con herencia autosómica recesiva, 3 genes con herencia autosómico dominante y 2 genes con herencia ligada al X. Se identificó un total de 12 variantes patogénicas o probablemente patogénicas, incluyendo: 5 missense, 2 nonsense, 1 frameshift y 4 variantes que alteran el splicing. Por otra parte, se describieron 5 variantes noveles, incluyendo una nonsense en CHM, una missense en BEST1 y 3 variantes de splicing en CACNA2D4, OFD1 y HK1. Para determinar la patogenicidad de las variantes de splicing se realizaron ensayos in vitro con minigenes, concluyéndose que c.2489-2A>G en OFD1 ocasionaba la deleción de las 6 primeras bases del exón 19.

En otra cohorte de pacientes en la que el estudio del panel de genes no había permitido identificar la causa genética de la enfermedad, se realizó un WES. Se incluyó 4 pacientes diagnosticados con retinosis pigmentaria. Sin embargo, solo se logró el diagnóstico genético preliminar de los hermanos RPN-464 y RPN-465. En estos probandos, se halló dos variantes missense en IFT140: una previamente descrita como patogénica y otra de significado clínico incierto. Su presencia en los dos hermanos afectos sugería que podría estar asociada al fenotipo de enfermedad. A considerar que originariamente IFT140 no había sido incluido en el diseño del panel de genes Desafortunadamente, no disponíamos de ADN de los progenitores, de manera que, no se pudo llevar a cabo el análisis de la segregación.

[EN] Inherited retinal dystrophies (IRD) are a group of diseases characterised by the progressive death of photoreceptors, leading to a visual function loss and even legal blindness. It is estimated that around 1 in 3000 individuals is affected, as a result, IRD are considered among rare diseases. Genetic diagnostic plays a key role in confirming clinical suspicions, providing proper genetic assessment and including patients in clinical trials based on therapies directed to certain genotypes.

In this work, we have established the genetic diagnosis of a patient cohort with an IRD clinical suspicion through directed sequencing. The gene panel is constituted by 114 genes, their corresponding flanking intronic regions and several deep intronic regions where mutations were previously reported. This approach has yielded a genetic diagnosis for 55% of the patients included in the cohort in accordance with the diagnostic ratios which had been previously reported in the literature. Furthermore, in probands P2 and P4 likely pathogenic or pathogenic variants were reported in several genes. Finding deleterious mutations in multiple genes can significantly impact patients¿ reproductive choices and eligibility for receiving a gene-specific genetic treatment.

In patients with a molecular diagnostic, mutations responsible for the disease were distributed across 8 different genes: 3 genes with an autosomal recessive inheritance, 3 genes with an autosomal dominant inheritance and 2 genes with X-linked inheritance. A total of 12 likely pathogenic or pathogenic mutations were identified, including: 5 missenses, 2 nonsenses, 1 frameshift and 4 splicing altering mutations. Moreover, we described 5 novel variants, including a nonsense variant in CHM, a missense variant in BEST1 and 3 splicing variants in CACNA2D4, OFD1 y HK1. In order to determine the pathogenicity of the splicing variant in vitro assays with minigenes were carried out, concluding that c.2489-2A>G in OFD1 leads to the deletion of the first six bases of exon 19.

In another patient cohort where the gene panel analysis was unable to identify the genetic origin of the disease, a WES was performed. We included 4 patients diagnosed with retinitis pigmentosa. Even though, we only achieved a preliminary diagnosis for siblings RPN-464 and RPN-465. In these probands, we found two missense variants in IFT140: a known pathogenic variant and a variant of clinical uncertain significance. Its presence in both affected siblings suggests that it could be associated with the disease phenotype. To remark that originally IFT140 was not included in the gene panel design. Unfortunately, we were lacking their parent¿s DNA, so we could not perform a segregation analysis.