Determinación del estado de oxidación de la alfa-1-antitripsina circulante en pacientes con déficit de alfa-1-antitripsina

Abstract

[ES] El déficit de alfa-1-antitripsina (DAAT) es una enfermedad rara monogénica, que provoca en los pacientes un desarrollo temprano de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y/o de daño hepático (cirrosis hepática y hepatocarcinoma). Estos pacientes se caracterizan por tener niveles séricos reducidos de la proteína alfa-1-antitripsina (AAT), lo que supone que tienen bajas concentraciones en los alveolos pulmonares, donde desarrolla su función protectora como inhibidora de proteasas. Debido a un exceso de actividad proteasa, las paredes alveolares son dañadas por la elastasa generada por los neutrófilos lo que conduce al desarrollo de enfisema. En el hígado, la acumulación de polímeros de AAT en el retículo endoplasmático, está asociado con daño mitocondrial y aumento de las vías de señalización de apoptosis, que llevan a la fibrosis y cirrosis hepáticas.

Esta enfermedad se produce debido a mutaciones en el gen de la SERPINA1, que codifica para la AAT y son responsables de la reducción de su concentración en circulación. Pese al gran número de mutaciones existentes en este gen, la gran parte de la población presenta estos 3 alelos: M, alelo normal; los alelos patológicos S y Z, siendo el último el que afecta con mayor gravedad a los pacientes.

Estudios previos realizados por nuestro grupo de investigación han demostrado que las proteínas totales de los pacientes con DAAT se encuentran más oxidadas que las de los controles sanos, ya que estos pacientes están expuestos a una situación de estrés oxidativo crónico. Como la exposición al estrés oxidativo reduce la afinidad de la AAT por la elastasa del neutrófilo, es importante conocer el grado de oxidación de la AAT (OxyAAT) para conocer el grado real de protección del paciente frente al daño generado por la elastasa del neutrófilo. Por lo tanto, el objetivo del trabajo es estudiar las posibles diferencias de OxyAAT circulante entre pacientes con DAAT e individuos control.

La medida se realizó mediante ensayos enzimáticos de inhibición de las proteasas elastasa (EIC) y tripsina (TIC) en muestras de suero mediante espectrofotometría. El porcentaje de OxyAAT se cálculo mediante la relación EIC/TIC.

Se han observado diferencias significativas en EIC entre los pacientes ZZ y el grupo control MM, además de una disminución gradual de EIC, siendo mayor en los controles MM y decreciendo escalonadamente en MZ y ZZ respectivamente. Por otra parte, pese a verse parcialmente reducida la TIC en pacientes MZ y ZZ, no se han demostrado diferencias significativas en la inhibición de la proteasa con el grupo control. Estas diferencias sí que se han podido percibir en el porcentaje de OxyAAT, observándose un mayor porcentaje de oxidación en pacientes ZZ que en los pacientes MZ y el grupo control. Este podría ser un factor más que explique el alto riesgo de los pacientes ZZ para sufrir enfisema.

En conclusión, nuestros resultados muestran un aumento de la oxidación de la AAT en pacientes con DAAT con fenotipo ZZ, lo que abre una hipótesis para el uso de terapias antioxidantes en el tratamiento de la enfermedad.

[EN] Alpha-1 antitrypsin deficiency (AATD) is a rare monogenic hereditary disease, that increases the risk to suffer from early chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or liver disease (hepatic cirrhosis and hepatocellular carcinoma) among patients. These patients are characterized for having lower alpha-1 antitrypsin (AAT) serum concentrations than non-affected people. This leads to lower alveoli activity of AAT, where it performs its protective function against the neutrophil elastase by inhibiting its protease activity. Due to an excess of protease activity, alveoli walls are damaged by neutrophil elastase and leads to the development of emphysema. In the liver, the accumulation of AAT polymers in endoplasmic reticulum vesicles are found in association with mitochondrial damage and an increase of apoptotic signaling pathways, which lead to fibrosis and hepatic cirrhosis.

This disease is produced by mutations in the gene SERPINA1 that encodes for AAT, which are responsible for its circulation level decrease. Although there are several variants of this locus, the most common alleles are: M allele, normal AAT; the pathologic alleles S and Z, being Z the one that affects patients with higher severity.

Previous works of our research group have shown that there is higher total protein oxidation in AATD patients than in healthy controls due to a chronic exposure to oxidative stress. Since oxidative stress reduces AAT affinity for the neutrophil elastase, it is important to know the oxidation state of AAT (OxyAAT) to understand the real degree of protection of the patient to the elastase damage. Thus, the objective of this work is to study the possible differences of circulatory OxyAAT between AATD patients and control individuals.

The measure was performed through enzymatic assays determining elastase inhibitory capacity (EIC) and trypsin inhibitory capacity (TIC) of serum samples by spectrophotometry. The percentage of OxyAAT was calculated through the EIC/TIC ratio.

EIC significative differences have been observed between ZZ patients and the control group MM, in addition to a gradual diminishment of EIC, being higher in MM group and decreasing gradually in MZ and ZZ patients. On the other hand, TIC has appeared to be partially reduced in MZ and ZZ patients even though no significant difference has been demonstrated. These differences have been proved to be statistically relevant for the OxyAAT percentage, which has shown to be higher in ZZ patients than in MZ patients and MM controls. This could be a factor that explains the high risk of ZZ patients to suffer emphysema.

In conclusion, our results display an increase in AAT oxidation in AATD patients carrying ZZ alleles, which offers new possibilities to study the benefits that these patients could have with antioxidant treatment.