Estudio de la actividad supresora del silenciamiento por RNA de la proteína P0 del virus de las venas amarillas del pimiento 5 (PeVYV-5): análisis de mutantes naturales y artificiales y de la influencia de factores del huésped.

Abstract

[ES] El silenciamiento por RNA es un mecanismo fundamental en la defensa de las plantas frente a virus. Los RNA de doble cadena víricos disparan este mecanismo al ser reconocidos por unas enzimas con actividad RNasa III, conocidas como DCL (Dicer-like), que median su procesamiento en pequeños RNA (small RNAs, sRNA) de entre 20 y 24 nucleótidos. A continuación, una de las cadenas de los sRNA se incorpora al complejo RISC (RNA-induced silencing complex), cuya molécula efectora es una endonucleasa de la familia de los Argonautas (AGO). Esta unión induce la activación del complejo y conduce a la degradación de RNA de secuencia complementaria al sRNA. Los virus, para luchar contra esta respuesta defensiva del huésped, producen proteínas supresoras del silenciamiento por RNA, abreviadas como VSR (viral RNA silencing suppressors), que son capaces de interferir con una o varias etapas de la ruta del silenciamiento.

El virus de las venas amarillas del pimiento 5 (Pepper vein yellows virus 5, PeVYV-5; género Polerovirus, familia Solemoviridae), es un patógeno detectado en España en los últimos años que forma parte de un grupo de virus emergentes que amenazan el cultivo del pimiento. Este agente infeccioso codifica una proteína conocida como P0, cuya actividad VSR ha sido constatada recientemente en el laboratorio y se ha propuesto que está basada en la degradación de proteínas AGO. Para continuar con el estudio de este supresor, en el presente trabajo se ha continuado con la caracterización molecular de una serie de variantes artificiales/naturales del mismo, lo que ha permitido establecer una correlación entre la actividad VSR de P0 y su capacidad para inducir la degradación de AGO. Estos resultados apoyan que el principal modo de acción de P0 es la desestabilización de los efectores de RISC. Además, los resultados han permitido comprobar que, pese a que distintas partes de la molécula P0 parecen estar involucradas en su actividad VSR, esta proteína es capaz de tolerar heterogeneidad de secuencia considerable manteniendo su función. Por último, se ha evaluado, mediante silenciamiento génico inducido por virus (VIGS), la posible participación de dos factores centrales en autofagia, ATG8f y/o ATG8c1, en la degradación de AGO promovida por P0. Los resultados no han permitido corroborar su participación, aunque serán necesarios experimentos adicionales para obtener datos concluyentes a este respecto.

[EN] Gene silencing is a fundamental mechanism in the defense against viruses. Viral double-stranded RNAs trigger this mechanism when they are recognized by enzymes with RNase III activity, known as DCL (Dicer-like), which mediate their processing into small RNAs (sRNA) between 20 and 24 nucleotides. Next, one of the sRNA chains is incorporated into the RISC complex (RNA-induced silencing complex), whose effector molecule is an endonuclease of the Argonaut family (AGO). This binding induces the activation of the complex and leads to the degradation of RNA complementary sequences to sRNA. Viruses, to fight against this host defensive response, generate RNA suppressor proteins, known as VSR (viral RNA silencing suppressors), which are capable of interfering with one or more steps of the silencing pathway.

Pepper vein yellows virus 5 (PeVYV-5; genus Polerovirus, family Solemoviridae) is a pathogen detected in Spain during the last years which belongs to an emerging group of viruses that threaten pepper culture. This infectious agent encodes a protein known as P0, whose VSR activity has been recently verified in the laboratory and it has been proposed that it is based on the AGO proteins degradation. To continue with the study of this suppressor, in the present work we have continued with the molecular characterization of a series of artificial/natural variants of the suppressor, which has made it possible to establish a connection between the VSR activity of P0 and its capacity to induce the AGO degradation. These results support that the destabilization of RISC effectors is the main mode of action of P0. In addition, the results have confirmed that, even though different parts of P0 molecule seem to be involved in its VSR activity, this protein can tolerate considerable sequence heterogeneity while maintaining its function. Finally, the possible participation of two central factors in autophagy, ATG8f and/or ATG8c1, in the degradation of AGO lead by P0 has been evaluated by viral induced gene silencing (VIGS). The results have not corroborated their participation, so additional experiments will be necessary to obtain conclusive data in this regard.