Estudio de las funciones de las cohesinas en el síndrome de Cornelia de Lange (SCdL)

Abstract

[ES] El síndrome de Cornelia de Lange (SCdL) es una enfermedad genética rara que afecta a múltiples órganos y sistemas durante el desarrollo. La causa del síndrome se debe a mutaciones heterocigóticas acaecidas durante el desarrollo embrionario, principalmente en el gen NIPBL. NIPBL se requiere para la asociación de cohesina con el ADN y es la subunidad principal del complejo que recluta la cohesina a la cromatina. En pacientes con mutaciones en NIPBL, se ha observado la caída drástica de los niveles transcripcionales de genes relacionados con el desarrollo y la organización del sistema esquelético, pudiendo tener esto relación con las alteraciones del desarrollo y las anomalías de las extremidades características de pacientes con SCdL. En parte debido a la escasez de muestras de pacientes, se quiere obtener un modelo de la enfermedad in vitro mediante la introducción de dos mutaciones en NIPBL encontradas en sendos pacientes con SCdL. Para llevar a cabo la edición génica se trabajó con el sistema CRISPR/Cas9 utilizando un ADN donante sintético que contenía la mutación a editar. Al mismo tiempo, se mutó la secuencia PAM para evitar posteriores cortes del enzima Cas9 y se introdujo un sitio de corte de un enzima de restricción para facilitar el rastreo de los posibles clones positivos. Tras la nucleofección de fibroblastos control, que fue anteriormente realizada en el laboratorio, se ha realizado el rastreo de clones editados genéticamente mediante la técnica de dilución serial limitante, pudiendo validar finalmente si incorporaron la mutación con una reacción de digestión con enzimas específicas. Los clones comprobados hasta el momento han resultado ser todos negativos. De forma paralela, mediante un ensayo in vitro de validación de la eficacia de los ARN diseñados para guiar a la endonucleasa Cas9, se ha comprobado que ésta realiza correctamente el corte en sitios específicos del ADN diana. Por otra parte, se ha visto que NIPBL regula la actividad ATPasa del complejo de cohesinas. En experimentos anteriores del laboratorio se diseñaron plásmidos que contenían la proteína control o NIPBL-Tyr2216Ser, ambas etiquetadas con GST. Tras la expansión y purificación de estos plásmidos, se han nucleofectado células HDF comerciales, extraído su proteína total y se ha realizado un Western Blot (WB) en gel de gradiente, detectando la proteína (316 kDa). Estudios posteriores incluirán la purificación de las proteínas etiquetadas para conocer si la proteína NIPBL-Tyr2216Ser tiene alterada la función reguladora de la actividad ATPasa del complejo de cohesinas.

[EN] Cornelia de Lange syndrome (CLS) is a rare genetic disease that affects multiple organs and systems during development. The cause of the syndrome is due to heterozygous mutations occurring during embryonic development, mainly in the NIPBL gene. NIPBL is required for the association of cohesin with DNA and is the main subunit of the complex that loads cohesin to chromatin. In patients with NIPBL mutations, a drastic drop in transcriptional levels of genes related to the development and organisation of the skeletal system has been observed, which may be related to the developmental alterations and limb abnormalities characteristic of CdLS patients. Partly due to the scarcity of patient samples, we want to obtain an in vitro model of the disease by introducing two mutations in NIPBL found in two CdLS patients. To carry out the gene editing, we worked with the CRISPR/Cas9 system using a synthetic donor DNA containing the mutation to be edited. At the same time, the PAM sequence was mutated to avoid subsequent Cas9 enzyme cuts and a restriction enzyme cut site was introduced to facilitate the screening of potential positive clones. Following nucleofection of control fibroblasts, which was previously performed in the laboratory, gene-edited clones have been screened using the serial limiting dilution technique and finally validated for mutation incorporation with a specific enzyme digestion reaction. The clones tested so far have all been found to be negative. In parallel, an in vitro assay to validate the efficacy of the RNA designed to guide the Cas9 endonuclease has shown that it correctly cleaves specific sites on the target DNA. Moreover, NIPBL has been shown to regulate the ATPase activity of the cohesin complex. Earlier experiments in the lab designed plasmids containing either the control protein or NIPBL-Tyr2216Ser, both labelled with GST. Following expansion and purification of these plasmids, commercial HDF cells have been nucleofected, their total protein extracted, and a gradient gel western blot (WB) performed, detecting the protein (316 kDa). Further studies will include purification of the labelled proteins to determine whether the NIPBL-Tyr2216Ser protein has altered regulatory function of the ATPase activity of the cohesin complex.