Efecto del silenciamiento del sistema Rab3A-Rab27A en la liberación de exosomas de podocitos sometidos a estrés de glucosa

Abstract

[ES] La nefropatía diabética es una de las complicaciones microvasculares más relevantes en el desarrollo de la diabetes mellitus. Actualmente, esta patología es una de las principales causas que llevan al fallo renal, por lo que profundizar en su estudio para establecer mejores diagnósticos y frenar su progreso, se ha convertido en un objetivo de gran interés para reducir el impacto de esta enfermedad. La hiperglucemia que la caracteriza es capaz de desencadenar efectos adversos en nuestro organismo, afectando principalmente a la actividad del riñón, puesto que puede comprometer la estructura de la barrera de filtración glomerular, que resulta clave en el correcto funcionamiento del glomérulo, siendo los podocitos unos de los componentes más afectados. Uno de los procesos más relevantes en el mantenimiento de la homeostasis y polarización celular de los podocitos es la comunicación intracelular a través del transporte vesicular. Se ha demostrado que las vesículas extracelulares, tales como los exosomas, desempeñan un papel fundamental en diversas enfermedades, siendo su cargo (proteínas, lípidos o microARNs entre otros) objeto de estudio como biomarcadores o dianas terapéuticas. El tráfico vesicular está regulado por algunas proteínas como las Rab GTPasas, de entre las cuales cabe destacar el sistema Rab3A-Rab27A, que ha sido descrito en diversos estudios en los procesos de transporte y exocitosis vesicular. Por todo ello, en este trabajo, se llevó a cabo el silenciamiento génico de ambas Rab mediante ARN de interferencia en podocitos tratados con concentraciones elevadas de glucosa, simulando las condiciones que se producen durante el desarrollo de diabetes. Para el estudio del efecto de esta inhibición, en primer lugar, se caracterizaron los podocitos y los exosomas objeto del posterior estudio. Por otro lado, se estudiaron los cambios ocurridos en el citoesqueleto de actina y la distribución de exosomas marcados con CD63 en el citoplasma de los podocitos mediante microscopía confocal así como el efecto sobre la expresión de los microARNs: miR-26a, miR-21-5p y miR-31-5p. Los resultados muestran que el silenciamiento de ambas Rab y el tratamiento con glucosa afecta a la organización del citoesqueleto y a la distribución de los marcadores exosomales en el citoplasma celular. Además, también se observó una alteración en los niveles de expresión de los microARNs estudiados en estas condiciones. Estos resultados sugieren que el sistema Rab3A-Rab27A, a través de su implicación en el tráfico vesicular, tendría un papel relevante en el daño podocitario ya que su inhibición parece reducir en cierta manera el daño ocasionado por el estrés por glucosa.

[EN] Diabetic nephropathy is one of the most relevant microvascular complications of diabetes mellitus. Currently, this pathology is one of the main causes leading to renal failure. Therefore, to improve diagnosis and halt its progress, further research is required to reduce the impact of the disease on human health. Hyperglycaemia is capable of triggering adverse effects in the organism, affecting kidney activity. It can endanger the structure of the glomerular filtration barrier, which is essential for the proper functioning of the glomerulus, where podocytes are one of the most affected components. Homeostasis and cell polarisation in podocytes are important processes that are held by intracellular communication through vesicular transport, in which Rab GTPase proteins are involved. Extracellular vesicles, such as exosomes, are involved in many diseases. Their cargos (proteins, lipids or microRNA among others) are considered potential biomarkers and therapeutic targets. Vesicular traffic is regulated by different types of proteins, such as Rab GTPases. Specifically, the Rab3A-Rab27A system has been described in transport and exocytosis processes in many research studies. Therefore, in this work, gene silencing effect of both Rabs by interference RNA in podocytes treated with high glucose concentrations was studied. To understand the effect of this inhibition, firstly podocytes and exosomes were characterised. Moreover, changes in the actin cytoskeleton and the distribution of CD63-labelled exosomes in the podocyte cytoplasm were studied by confocal microscopy, as well as the effect on the expression of microRNAs: miR-26a, miR-21-5p and miR-31-5p. The results show that the organization of the cytoskeleton and the distribution of exosomal markers in the cell cytoplasm were affected by silencing of both Rab and glucose treatment. In addition, altered expression levels of the microRNAs studied under these conditions were also observed. These results suggest that the Rab3A-Rab27A system, as it participates in vesicular trafficking, may have a relevant role in podocyte damage. The inhibition of the system seems to reduce the damage caused by glucose stress.