Identificación de patógenos emergentes en FLA procedentes de vegetales orgánicos mediante DVC-FISH

Abstract

[ES] Actualmente el consumo de vegetales orgánicos presenta una tendencia creciente, debido a una mayor preocupación por el medio ambiente. Sin embargo, al no utilizar fertilizantes, herbicidas o pesticidas químicos, este tipo de cultivos puede conllevar un riesgo asociado debido a la posible presencia de ciertos organismos como las amebas de vida libre (free-living amoebae, FLA). Estos protozoos pueden actuar como reservorios de microorganismos vivos, pudiendo ser algunos de estos, patógenos humanos. Las técnicas microbiológicas convencionales como el cultivo permiten la detección de microorganismos, pero resultan poco específicas, y, en ocasiones, los organismos pueden adoptar el estado viable no cultivable (VBNC), no pudiéndose detectar mediante este método. Por ese motivo, se decidió analizar el contenido bacteriano del interior de estas FLA por medio de la técnica molecular DVC-FISH, que permite la detección de formas bacterianas viables debido a la preincubación en el medio DVC (favorece el crecimiento, pero no permite la división celular) combinándose con la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) que emplea sondas fluorescentes específicas. Este método permite diferenciar el género o incluso la especie de las bacterias que se quieren identificar y además confirmar la viabilidad de estas.

Se analizaron diversas muestras de vegetales y frutas orgánicas para, en primer lugar, determinar cualitativamente la presencia de FLA, y posteriormente, detectar la presencia y viabilidad de bacterias de los géneros Pseudomonas, Salmonella, Listeria y Helicobacter como parte del microbioma de las FLA aisladas de dichos vegetales y frutas orgánicas.

Se procesaron un total de 35 muestras representativas de vegetales y fresas ecológicas, pertenecientes al proyecto `ECOFOOD¿. En todas las muestras se recuperaron FLA por cultivo (100%). Los resultados del DVC-FISH indicaron la presencia de células viables de Pseudomonas spp. en un 88,57% de las muestras y, de Salmonella spp. en un 2,86% de las muestras como parte del microbioma de las FLA aisladas. En cambio, no se detectó Helicobacter spp., ni Listeria monocytogenes. La presencia de ciertas bacterias internalizadas de interés para la salud pública, indica que las FLA son posibles vehículos de transmisión de patógenos, ofreciéndoles protección y favoreciendo su diseminación.

[EN] Currently organic vegetables consumption presents a growing trend, due to higher concern about environment. However, as chemical fertilizers, herbicides and pesticides are not used, this type of cultivation may carry an associated risk due to the possible presence of certain organisms, such as free-living amoebae (FLA). These protozoa can act as reservoirs of alive microorganisms, some of which may be human pathogens. Conventional microbiological techniques such as culture allow the detection of microorganisms, but they result not very specific, and occasionally, organisms can adopt the viable non-culturable state (VBNC) and cannot be detected by this method. For this reason, analysing the internal content of this dangerous amoeba was decided through the molecular technique of DVC-FISH, that allows the detection of viable bacterial forms due to preincubation in DVC medium (it promotes cell growth, but it does not permit cell division) combined with the fluorescent in situ hybridization (FISH) technique that uses specific fluorescent probes. This method allows to differentiate the genus or even the bacterial specie that wants to be identified and it enables to confirm their viability.

Organic vegetable and fruit samples were studied in order to firstly, qualitatively establish the presence of FLA, and subsequently, determining the presence and viability of bacteria from the genus of Pseudomonas, Salmonella, Listeria and Helicobacter as a part of isolated FLA microbiome from the organic vegetables mentioned.

A total of 35 representative samples of organic vegetables and strawberries were processed from the 'ECOFOOD' project. In all samples FLA were recovered by culture (100%). Results of DVC-FISH indicated the presence of viable cells of Pseudomonas spp. in 88,57% of the samples and Salmonella spp. in 2,86% of samples as part of microbiome isolated from FLA. In contrast, neither Helicobacter spp. nor Listeria monocytogenes was detected. The presence of certain internalized bacteria of interest for public health indicates that FLA are possible vehicles for the transmission of pathogens, offering them protection and favouring their dissemination.